葡萄RAPD最适反应体系建立和影响因子探讨.pdfVIP

首届干旱半干旱区葡萄产业可持续发展国际学术研讨会论文集 葡萄RAPD最适反应体系建立及影响因子探讨 赵怀宝1·2·8胡光辉3 (1中国科学院新疆生态与地理研究所，乌鲁木齐830011；2中国科学院研究生院，北京 100049；3奎屯市园林局，奎屯833200) 这五个因子，每因子四个浓度水平进行正交试验设计，对供试品种的DNA进行PCR扩增，分析影响RAPD—PCR 反应的因子，优化RAPD分析的反应条件，建立起葡萄属植物RAPD分析高重演性，高可靠性，经济的试验技术 体系，葡萄属植物RAPD分析的最适反应体系为：10ul反应混合液中，模板20ng，引物25ng，dNTP200uM， 究打下基础。 关键词：葡萄 RAPD RAPD标记技术是近年来发展起来的一种新的多态性DNA标记技术，称随机扩增多态性 DNA技术(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态DNA)。它是建立在PCR Chain (PolymeraseReaction，聚合酶链式反应)基础上的一种新型DNA分子水平上的遗传标记。 RAPD具有检测效率高。灵敏，对材料要求不高，取材少，成本低等特点，已被广泛应用于遗传 学、分子进化学和生物分类学诸领域u1。越来越多的证据表明：由于RAPD技术采用的引物较 短，反应快速、灵敏、高效；退火温度低，导致对其反应条件很敏感，稳定性较差，且不同物种 对反应的要求也存在差异[21。因此，在RAPD分析中，有必要针对不同的研究对象予以反应体系 和分析条件优化，在优化RAPD分析反应条件的基础上，做到操作规范，保持反应条件的一致， 并选择那些扩增稳定的主带进行分析，RAPD分析的准确性和可重复性是可以保证的。 果树遗传学研究基础薄弱，作为无性繁殖的多年生果树其基因型高度杂合，育种周期长，盲 目性大，而且，大多数重要的经济性状是受多基因控制的数量性状，这在一定程度上阻碍了果树 遗传育种研究的进程和新品种的获得。RAPD技术能迅速、大量的产生分子位点，有利于辅助育 种，简化选择，对优良性状及抗性的间接选择，早期鉴定等有很高的应用价值[31。 巨峰系葡萄是目前国内外主栽的葡萄主要鲜食品种之一。以前曾有人对许多新疆葡萄品种进 行过染色体、同工酶等遗传标记的研究，但DNA分子标记的研究尚少见报道。因此，与形态学、 细胞学、生化标记相比，在优化的反应体系基础上，应用RAPD分子标记技术为葡萄属植物及其 它果树应用RAPD技术进行转基因植株检测，遗传图谱的构建、基因标记、系统发育关系分析， 种质资源的分类、品种鉴定、系谱分析、品种注册、专利保护、病毒鉴定，体细胞杂种的鉴定 【4】，突变体筛选，分子标记辅助选择育种及优良性状及抗性的间接选择，早期鉴定等等方面的应 177 品种与栽培技术 用探索新的途径，其意义是很大的。 1．材料和方法 1．1试验材料： 试验材料取自石河子农科中心葡萄站葡萄品种资源圃。供试品种为巨峰系巨峰。取材时间为9 月25日(果实成熟至落叶前)。取巨峰等品种幼嫩叶片，用蒸馏水清洗除去表面污物，用纱布或滤 纸吸干表面残留水分，去掉叶柄，标记分装，置一20℃冰箱冷冻保存备用。 1．2试剂和溶液： 1．2．1 DNA提取、纯化试剂和溶液： SDS(OB0600—1，Serva20760)，溴酚蓝(Sp0025—1SigmaB7021)，8一羟基喹啉(OB0340—1 SigmaH6878)，2一巯基乙醇(p—Me：OB0381—1Merck)均系进口分装产品，购自北京天象人生物 工程公司。十六烷基三甲基溴化铵CTAB、聚乙烯吡咯烷酮PVP、苯酚及其它有关提取、纯化试 剂均系国产分析纯。 1．2．2 mixSolution 带产品。Ficoll400(IR0165—1pharmacia170400—02)，dNTPKit(DR0080一1，德国 SerumAlbumin：Mw0005—1 B．M．公司，其中各浓度10mM，PH7．0)，BSA(