珠海红树林海洋真菌代谢物抗肿瘤活性筛选.ppt

珠海红树林海洋真菌代谢物抗肿瘤活性筛选 答 辩 人：吴水平 指导老师：蔡小玲 讲师 研究背景和意义 海洋微生物天然产物是近年来寻找新药的国际研究热点，从海洋微生物的天然产物中筛选具有活性的化合物成为先导化合物，具有重大的理论意义和应用价值。 红树林作为海洋与陆地植物圈的接合部，其伴生的微生物类群属海洋微生物，又具有植物内生微生物的特点，这也造就了红树林内生真菌具有独特的代谢途径和遗传背景，因此对它们的代谢产物进行活性物质的筛选研究可能会有可喜的发现 。 研究出发点及创新之处 一般抗肿瘤药物长期使用后肿瘤细胞会出现对它们的耐药性，而人拓扑异构酶Ⅰ（hTopoⅠ）靶位药物在临床上不易出现耐物性。 由于细胞代谢的特异性，分子水平上以hTopoⅠ为靶位的体外筛选模型筛选得到的有效样品进入细胞后可能会被代谢转化成无活性的产物。同时在分子水平和细胞水平上进行抗肿瘤药物活性筛选，综合两者的筛选结果，会得出更为有效可靠的结果。 实验思路 一共分离出红树林海洋真菌209株，具体情况见下表。 代谢物对hTopoⅠ抑制活性筛选 统计结果 筛选出ZH116、ZH178、ZH71、ZH11、ZH154、ZH55、ZH30、ZH15、ZH50、ZH45、ZH44、ZH58、ZH151、ZH93、ZH34、ZH228、ZH74、ZH182和ZH72共19株海洋真菌的代谢物有较强的hTopoⅠ抑制作用；另外有ZH61、ZH88、ZH79、ZH218、ZH68、ZH82、ZH83、ZH64、ZH10、ZH135、ZH209、ZH81和ZH164共13株菌的代谢物也对hTopoⅠ有一定的抑制活性；剩余22株菌的代谢物要么没有抑制活性，要么抑制作用太弱。 收集对数生长期的受试靶细胞，接种于96 孔板，每孔190μL（约1×104个细胞/孔），24小时 后加入不同梯度浓度药物10μL，每一浓度3个重复孔。同时设置调零孔、对照孔。培养68小时后加入MTT 10μL（浓度为5mg/mL）。继续培养 4小时后弃上清，每孔加入DMSO 100μL后用酶联免疫检测仪测定492nm处吸光度 OD 值， 以药物浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制抑制曲线。对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度。 细胞毒实验结果 结论1 19株代谢物对hTopoⅠ有较强抑制作用的海洋真菌中，有ZH228、ZH116、ZH151、ZH58、ZH30、ZH44、ZH71、ZH15、ZH154共9株真菌的代谢物能强烈抑制肿瘤细胞的生长。据此可以确定这9株真菌的代谢物中含有以hTopoⅠ为靶位点的强效抗肿瘤化合物，其中以ZH228、ZH116、ZH151、ZH58四株真菌的作用效果最好，应该作为优先研究的对象。 另外的10株对hTopoⅠ有较强抑制作用的海洋真菌尽管在肿瘤细胞毒试验也有一定的抑制效果，但不是太强，可能跟其活性化合物的稳定性差有关，进入细胞后被代谢成低活性的化合物，抑制效果也相应下降，研究价值不大。 结论2 16株具有较强细胞毒作用的真菌中，除了9株对hTopoⅠ有强烈抑制作用外，剩下的7株真菌中，ZH64、ZH82、ZH88、ZH135对hTopoⅠ只有一般的抑制作用，但却能强烈抑制肿瘤细胞，可能是体外以DNA拓扑异构酶Ⅰ为靶位点的抗肿瘤药物筛选模型与细胞内环境有一定差别，此四株菌也有一定的研究前景。 最后剩下ZH75、ZH97、ZH177三株菌，没有hTopoⅠ抑制活性，但却能强烈抑制肿瘤细胞生长，估计其靶位点另有所在，也可对进一步研究，以期发现新的抗肿瘤药物的靶点。 结论3 hTopoⅠ细胞外筛选方法适于高通量筛选，且筛到的化合物靶位明确，利于进一步深入研究。虽然细胞外筛选与细胞内实验存在一些系统差别，但 19个hTopoⅠ抑制剂中有9个具有较强的抑制肿瘤细胞生长的能力，占总数的47.4％，表明应用hTopoⅠ细胞外筛选模型可提高筛选效率。 * * * * * 中山大学化学与化学工程学院第八届创新化学实验与研究基金项目结题答辩 化学与化学工程学院海洋天然有机物研究室 从珠海红树林植物组织及根部泥样中分离出新的海洋真菌菌株 。 通过以人DNA拓扑异构酶Ⅰ为靶位点的抗肿瘤药物筛选模型进行真菌代谢物抗肿瘤活性初筛 。 用 MTT法测试真菌代谢物对受试肿瘤细胞的细胞毒性 。 从真菌培养液中获取中等极性的真菌代谢粗提物 确定以人DNA拓扑异构酶Ⅰ为靶位点的抗肿瘤活性菌株 209 23 6 37 16 27 20 9 71 合计 30 4 4 8 1 5 8 果 3 1 1 1 花 38 9 3 3 8 2 5 8 叶 51 3 7 6 3 7 25 皮 48 3 2 11 5 5 3 3 16 茎 19 1 9 2 7 根 20 4 8 1 7 根部泥 合计 银