实验六 植物细胞骨架的制片及光学显微镜观察.ppt

实验六 植物细胞骨架的制片及光学显微镜观察 一、实验目的 ?掌握细胞染色的基本过程及非切片法制片技术，了解细胞骨架的结构 二、实验原理 细胞内脂质和大部分蛋白质可与去垢剂Triton-100形成去垢剂-蛋白/脂质复合物，从而溶于水中被提取，而结合成纤维状的微丝束属于不可溶性蛋白，就不会被Triton-100破坏而保持其在生活细胞中存在的状态。之后用考马斯亮蓝R250对蛋白质染色，使骨架系统在光学显微镜下可见，从而对其进行观察研究。 三材料与方法 3.1 材料 新鲜洋葱鳞茎，撕取内表皮，切成约0.5cm×0.5cm大小。 3.2 器材 光学显微镜、精确天平、0.02ml移液枪、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子。 3.3 试剂： M-缓冲液：50mmol/L咪唑、50mmol/LKCl、0.5mmol/LMgCl2、0.1mmol/LEDTA、1mmol/LEGTA[乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸]、1mmol/L巯基乙醇。 6mmol/LPH6.8磷酸缓冲液：0.2149g Na2HPO4·12H2O、0.0816g KH2PO4 加入100ml 蒸馏水。 1％TritonX-100：0.5ml 100％TritonX-100加入A液49.5ml。 0.2％考马斯亮蓝R250：0.2g考马斯亮蓝R250粉加入甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。 3％戊二醛：6ml 25％戊二醛加入B液44ml。 3.4 方法 A?撕取洋葱鳞茎内表皮约1平方厘米大小，取若干片，将材料置于装有PH6.8磷酸缓冲液的烧杯中，使其下沉浸没5分钟。 B?吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX-100处理30分钟。 C?吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次10分钟。 D?用3％戊二醛固定0.5-1小时, 用磷酸缓冲液洗三次，每次10分钟。 E?0.2％考马斯亮蓝R250染色30分钟。用蒸馏水洗1-2次，展平置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。选取骨架形态清晰、典型的细胞或细胞群，在适当放大倍数下摄像。? 四、 作业 1．记录并图绘实验结果 2．试说明实验中各试剂的作用 图1洋葱鳞茎内表皮细胞骨架显微镜照片 b：10×40倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（上方箭头示膜骨架，下方箭头示胞间连丝处骨架纤维） c：10×100倍光镜下病变细胞骨架与正常细胞的对比（注意两箭头处染色对比） * * a：10×10倍光镜下洋葱鳞茎内表皮细胞骨架（箭头示细胞核区域重染色区） *