RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系的建立和鉴定.pdfVIP

2015年 2月 基础医学与临床 February2015 第 35卷 第2期 Basic ClinicalMedicine Vo1．35 No．2 文章编号：1001—6325(2015)02-0218-06 技 术 与 方 法 RACK1过表达和低表达 HUVEC细胞系的建立和鉴定 张 丽 ，贾雄飞 ，牛 华 ，冯 悦 ，宋玉竹 ，张望龙 ，李胜营 ，吴明江 ，毛小琴。 (1．昆明理工大学 生命科学与技术学院 分子病毒实验室，云南 昆明650500；2．解放军昆明总医院检验科， 云南 昆明650032；3．昆明理工大学 附属医院云南省第一人民医院检验科，云南 昆明650032； 4．云南大学 化学科学与工程学院 自然资源药物化学重点实验室 ，云南 昆明650091) 摘要 ：目的建立有活性的蛋白激酶C受体1(RACK1)过表达和低表达人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)，为进一步 从分子水平研究RACK1在心律失常中的作用机制提供有效手段。方法 扩增RACK／基因的全长cDNA序列，并插 入plRES2。EGFP获得过表达载体plRES2-EGFP—RACK1；同时，设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴 性对照序列，亚克隆至 pGenesil．1得到相应 的干扰载体 ；脂质体转染法将重组体及相应 的空质粒分别转染至 HUVEC细胞，经 G418筛选抗性细胞克隆，qRT．PCR及 Westernblot鉴定 RACK1mRNA和蛋 白的表达。结果 RACK1真核表达载体和RNA干扰载体构建成功。重组体经脂质体法转染HUVEC48h后 ，经 G418筛选 3周得到 细胞抗性克隆，qRT．PCR及Westernblot结果证实了过表达载体和干扰载体能有效的增强和沉默HUVEC细胞中 RACK1的表达。结论 成功建立了RACK1过表达和低表达 HUVEC细胞系。 关键词：。RACK1；过表达；RNA干扰；HUVEC细胞系 中图分类号：Q291 文献标志码：A EstablishmentandidentificationofHUVEC cellstrainswithover-expressionandlow expressionofRACK1 ZHANGLi ，JIA Xiong—fei ，NIU Hua。，FENGrue ，SONGYu—zhu ，ZHANGWang—long， LISheng—ying，‘wuMin iang4，MAOXiao-qin¨ (1．LaboratoryofMolecularVirology，CollegeofLifeScienceandTechnoloyg，KunmingUniversityofScienceandTechnoloyg，Kunming650500； 2．Dept．ofClinicalLaboratory，KunmingGeneralHospitalofChinesePLA，Kunming650032；3．Dept．ofClinicalIm．boratory ，theAffiliatedHospital ofKunmingUniversityofScienceandTechnoloyg ／theFirstPeoplesHospitalofYunnna Province，Kunming650032；4．KeyLaboratoryof MedicinalChemistry forNaturalResource，CollegeofChemical ScienceandTechnoloyg ，Yunnna University，Kunming650091， China) Abstract：Objective Toestablishseveralhumanumbilicalveinendotheli~ cell(HUVEC)strainswithover—ex— press