TNIP1真核表达载体的构建及表达.pdfVIP

昆明医科大学学报 2015，36(1)：38—42 CN 53—1221／R JournalofKunmingMedicalUniversity TNIP1真核表达载体的构建及表达 喻 丽 ”，李梅章 ，李金荣 ，李晓岚 ) (1)昆明医科大学附属延安医院皮肤性病 ／风湿免疫科，云南 昆明 650051；2)云南大学生命科学院生 物化学和分子生物学实验室，云南 昆明 650091；3) 昆明医科大学第二附属医院泌尿外科，云南 昆明 650101) [摘要 ] 目的 构建 肿瘤坏死 因子 诱导蛋 白 3相互作 用蛋 白 1(TNIP1) 真核 表达载体 (pEGFP—N3一TNIP1)，观察了解外源TNIP1蛋白的细胞 内定位及其在HeLa细胞中的表达．方法 应用 RT—PCR 从人外周血淋巴细胞中扩增TNIP1基因的开放阅读框 (ORF)，将 目的片段亚克隆入pEGFP—N3中，筛选阳性克 隆，提取质粒测序进行鉴定．将表达质粒转染HeLa细胞 ，荧光显微镜观察融合蛋白在细胞内的表达与定位，实 时荧光定量 PCR (qRT—PCR)和蛋白质免疫印迹分别从mRNA水平和蛋白水平来检测TNIP1在 HeLa细胞中的表 达情况．MTF实验检测细胞增殖情况 、流式细胞仪检测细胞周期．结果 重组质粒双酶切鉴定，在 1．9kb左右有 明显 的条带 ，DNA测序结果证实重组质粒 pEGFP—N3一TNIP1中含有的 目的基 因片段与 GenBank上登录号为 BC014008．1的TNIP1基因序列完全一致 ；荧光倒置显微镜观察重组质粒转染 HeLa细胞后有绿色荧光蛋白的表 达，转染48h后通过 qRT—PCR和Westernblot分别检测到TNIPlmRNA和蛋白质的表达 ，均较对照明显升高，外 源性的TNIP1蛋白主要定位于细胞质中．结论 成功构建了pEGFP—N3一TNIP1真核表达载体，外源表达的TNIP1蛋 白主要分布于HeLa细胞的细胞质部分 ，过表达TNIP1蛋白不影II~HeLa细胞的细胞周期及细胞生长存活． [关键词]TNIP1蛋白；HeLa细胞；基因克隆；表达 [中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]2095--610X (2015)O1—0038—06 CcoonnssttrruuccttiioonnaanndEXxPpressionofEukaryOottiiCcEEXxPpressionVVeeccttoorr pEGFP-N3-TNIP1 YULi”，LIMei—zhang ，LIJin—rong ，LIXiao—lan (1)Dept．ofDermatologyRheumatology，AffiliatedYah’anHospitalofKunmingMedicalUniversity， KunmingYunnan650051；2)BiologicalChemistryandMolecularBiology，LifeofSchoolsofYunnan University，KunmingYunnan650091；3)Dept．ofUrology，The2ndAffiliatedHospitalofKunmingMedical University，KunmingYunnna 650101，China) lAbstractlObjective ToconstructeukaryoticexpressionvectorpEGFP—N3一TNIP1andtoobservethe expressioninHeLacells．Methods pEGFP—N3一TNIP1vectorwasconstructedaccordingtothestandardmolecular cloningstrateg{es．TotalRNA andproteinwe