MALDI+Biotyper高通量微生物鉴定系统在台湾进口鳖蛋检疫中的初步应用.pdfVIP

动物检疫学分会2010年年会论文集 MALDl Bi r高通量微生物鉴定系统在台湾进口 otype 鳖蛋检疫中的初步应用 徐淑菲孔繁德 (厦门出入境检验检疫局技术中心，福建厦门361026) 的检测．方法按照病原菌检测标准进行培养，选取可疑菌株，肉汤培养后，按照 软件对所获取的质谱图进行分析。结论应用MALDI．TOF．MS方法从进口鳖蛋中分离出绿 脓杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌等致病菌，为进出口商、检验机构及其他相关部 门敲响警钟。此鉴定方法简单快速，能够加快鳖蛋的通关速度，为两岸建设作贡献。 关键词：鳖蛋；MALDI．TOF．MS；质谱图；病原菌 鳖，俗称甲鱼、水鱼、团鱼和王八等，是一种深受广大消费者欢迎的水产品。自90年代 以来，由于鳖价大幅飚升，刺激了养鳖业的超常发展，1993年鳖产量仅4427吨，1994年产量 一跃达至U9360吨，增加1．2倍，至1997年即达4万余吨，5年增长了10倍。尽管国内养鳖业迅 速发展，但远远不能满足市场的需求，仍然以进口外来鳖蛋孵化苗种为主，其中多数是台湾 鳖蛋，有小部分蛋来自泰国、印尼等。台湾进口鳖蛋占了重要的地位，而厦门口岸作为大陆 距离台湾最近的口岸，有着得天独厚的地理优势。台湾年产5亿粒鳖卵，有八成输往大陆孵 化成鳖，而厦门口岸进口台湾鳖蛋的进口量占台湾产量三成，厦门口岸已成为台湾鳖蛋销往 内地的首要集散地。 MatrixAssistedLaser 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(姒LDI—ToF—Ms， Desorption／Ionization，Time—of—F1ight，mass spectrometer)是近年来发展起来的一 种新型的软电离生物质谱，在国外MALDI—TOF—MS方法已在医学方面取得不俗的成果。国内 方面，2003年，杜宗敏等应用ldALDI—TOF-MS技术，进行金黄色葡萄球菌及其甲氧苯青霉 素耐药性的研究，利用细菌指纹图谱和数据库检索对大多数菌株实现了正确鉴定…；2008 方法分别应用于真菌的蛋白质谱分析及沙门菌检测、鉴定分型中等等口1。但在进出口检测 方面还没有报道过，本研究将以此方法对从厦门口岸进口的鳖蛋样品进行检测。 在甲鱼蛋进口过程中，其携带的病菌随其运输而传播，不仅降低甲鱼蛋的孵化率，影响 甲鱼苗的健康体质，而且影响人类食用安全。关于其所携带何种病菌，其致病性如何，对人 类健康有何危害，至今仍然是个谜。揭开这个谜底，能够建立有效的检验监督机制，进一步 加强海峡两岸甲鱼蛋交易，促进对台贸易往来，为海西建设做出贡献。 l材料与方法 1．1试剂 1-1．1培养基 肉汤、麦康凯琼脂、缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸钠煌绿(，rTB)、亚硫酸铋(BS) 琼脂、肛琼脂、碱性蛋白胨水、庆大霉素琼脂、李氏增菌肉汤LB、PALCAM琼脂、7．5％氯 动物检疫学分会2010年年会论文集 化钠肉汤、血平板等培养基购自北京陆桥技术有限公司。 1．1．2其他试剂 无水乙醇购自厦门绿茵化玻有限公司，甲酸、乙腈、二氟乙酸、氰基肉桂酸为BRUKER DALTONlOS公司随仪器提供。 1．2方法 1．2．1实验材料的准备 取同批样品中十枚左右鳖蛋，无菌环境中破碎，使之均匀。 1．2．2细菌分离 1．2．2．1用培养基1分离无菌取25g鳖蛋匀浆，加入到225mL肉汤中，37C培养过夜， h-24 取1lIlL加入到lOmL肠道增菌液中，42℃18h；将增菌液划线接种麦康凯或伊红美 兰琼脂平板，37℃过夜。 mLBPW中，37℃过夜， 1．2．2．2用培养基2分离无菌取25g鳖蛋匀浆，加入到225 h-24 取lmL转种于TTB或删中，42℃18h，将增菌液划线接种脏琼脂平板和BS琼脂平 板。