固定化人工膜(IAM)动态固载胰蛋白酶的条件优化.pdfVIP

全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 C12固定化人工膜(IAM)动态固载胰蛋白酶的条件优化 李花王珊珊林真光屈锋耿利娜李勤邓玉林 北京理工大学生命科学与技术学院中国北京100081 artificial 以固定化人工膜(immobilizedmembrane，IAM)为基质研究胰蛋白酶的动态固 定化，考察了缓冲液种类、浓度及pH值对胰蛋白酶在IAM上的固载率和酶活的影响。 动态固定化酶方法是一种物理吸附，是范德华力、离子相互作用、疏水相互作用和氢键 等多种作用力共同作用的结果，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，且载体可重复利 用。MM是将卵磷脂共价键合在硅胶上的一种固定相基质，模拟了细胞膜的极性头部的亲水 作用和尾部碳链的疏水作用，具有生物亲和性。当游离态的酶经过nM表面时，通过物理吸 附固定在IAM上，形成酶反应器。吸附法制备的固定化酶反应器，其稳定性受溶液的pH值、 缓冲液类型、离子强度、温度和底物浓度影响较大11】。本课题选择硼酸盐、磷酸盐和Tris·}ic】 三种缓冲液体系，考察了缓冲液浓度及pH值对tAM固载胰蛋白酶的影响，并建立以酪蛋白 为底物测定固定化胰蛋白酶活性的方法【2】，优化了胰蛋白酶的动态固定化条件，为进一步研 究在线固定化酶解反应器奠定基础。 实验结果表明：缓冲液种类并不是影响nM固定化胰蛋白酶固载率的主要因素，主要因 素是缓冲液的浓度和pH值；在0．1mol／L的硼酸盐、PBS和吖s-HCI三种缓冲液条件下圆定 IAM，对应的pH值分别为8．0、 化胰蛋白酶，其最大固载量分别为0．282、O．299和O．281rag／rag 5．7和9．0。硼酸盐和Tris·HCI缓冲液在碱性范围内固载率较高，而PBS缓冲液则相反，在酸 性范围内固载率较高(如图1)；三种pH=8．0的缓冲液对胰蛋白酶的固载率均随盐离子浓度的 增大而递减(如图2)，说明较高的盐离子浓度可能会减弱胰蛋白酶与载体的结合力。硼酸盐、 磷酸盐和Iris·Hcl三种缓冲液在pH7～9时，酶活保持较高水平，最高酶活力单位分别为o．327、 O．264和0．329 U／rrd，对应的pH值分别为8．0～8．5、8．4和7．0：硼酸盐和强s·HCI缓冲液条件 下固定化胰蛋白酶的酶活较高，酶活力单位曲线随pH值梯度变化比较平缓，而PBS缓冲液 条件下的胰蛋白酶酶活较低，其酶活力单位曲线随pH值梯度变化波动较大(如图3)；在低盆 离子浓度缓冲液中，胰蛋白酶的固载量和酶活力均较高(如图4)。 综合实验结果，初步选择IAM动态固定化胰蛋白酶的最佳条件为：pH=8．0，浓度为10raM 的Tris．HCl缓冲液。固定化条件的优化是为胰蛋白酶在线酶解器的研究奠定基础。在最佳的 114 全国生物医药色谱学术交流会(2008)论文集 固载条件下，将胰蛋白酶固定在填充于毛细管微柱的队M上，制备胰蛋白酶在线酶解器动态 固定化酶解反应器，实现蛋白质样品的在线酶解、分离和鉴定。 ；0．35 {—·～Tris—HCI：。 一+T『is—HcI·． n3 l二：款l “·PBs }_ 25 1兰o —卜硼睃盐．!{ ：{0．2 30．15 ’■ 【骚0．1 1圄 O，05 “一一 。“～‘ 0