鹅细小病毒原位PCR检测方法的建立及应用.pdfVIP

590蟋》2010年学术年会 T040062 鹅细小病毒原位PCR检测方法的建立及应用 饶桂波董浩段小波蒋运博胡桂学 (吉林农业大学，吉林长春130118) 引言／目的 parvovirus，GPV)是小鹅瘟(goslingplague，GP)的病原体，是严重危害养鹅 鹅细小病毒(goose Bank中已发表的GPV的B株基因序列设计特异性引物和寡核苷酸 业的重要病原之一。本研究根据Gene 标记探针，优化样品处理、原位PCR扩增和原位杂交等条件，建立对组织中GPV核酸进行检测和定位的 间接原位PCR方法，并通过对自然感染GPV高免血清紧急免疫后第6天的鹅肝脏和空肠组织进行检测， 初步将间接原位PCR用于小鹅瘟的诊断和流行病学调查。 材料方法 根据GPV的VP3基因序列设计PCR引物和寡核苷酸探针，以GPV感染鹅肝脏和空肠组织石蜡标本制 作切片，经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和碱性磷酸酶标记的寡核苷酸探针原位杂交，建立了检测石蜡 标本中GPV的间接原位PCR方法并应用于自然感染GPV高免血清紧急免疫后鹅肝脏和空肠组织临床病 料检测。 结果 间接原位PCR对人工感染GPV死亡鹅肝脏和空肠的石蜡标本检测结果为阳性，而鹅病毒性肝炎、鹅 多杀性巴氏杆菌病、鹅沙门氏菌病和鹅大肠杆菌病死亡鹅肝脏的石蜡标本检测结果为阴性；间接原位 PCR对自然感染GPV高免血清紧急免疫后第6天的鹅肝脏和空肠组织检测20个样本中，空肠组织有8个呈 阳性，肝脏组织有4个阳性结果均为阳性，阳性细胞有空肠上皮细胞、肝窦上皮细胞等。 讨论 试验过程中蛋白酶K的处理是关键的一步，蛋白酶浓度及处理的时间和温度对结果好坏都有直接影响； 处理过度可造成细胞形态损伤，阳性信号难以辨认；处理不足则造成探针无法穿透膜蛋白，检测不到阳性 信号。因此我们对实验条件进行了优化，在切片的厚度为8 rain Hm时，蛋白酶K浓度为10ng／mL，37C消化20 可以得到较好的实验结果。杂交液中硫酸葡聚糖的浓度同样也很关键，如果没有合适浓度的硫酸葡聚糖， 杂交会失去敏感性；然而，浓度过高会使杂交液的粘度增加。为了防止探针分布不均从而导致杂交信号不 均匀，一定要彻底混匀杂交液。因此在实验中我们选用了浓度10％的硫酸葡聚糖，得到了较好的实验效果。 选取的20个发病雏鹅种群幸存样本中，在用高免血清紧急免疫后第六天，其空肠组织仍有8个样本病毒DNA 检测呈阳性，阳性率达到了40％：在空肠组织呈阳性样本中，有4个肝脏组织样本呈阳性，阳性率达到了20％。 由此可见，高免血清紧急免疫对小鹅瘟的紧急防控和治疗起到了一定作用，而且空肠组织较肝脏更易于GPV 的定植。 参考文献(略)