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李RAPD反应体系的优化建立 冯晨静1 刘威生2杨建民1张启3 (1河北农业大学园林与旅游学院，保定071001；2辽宁省农业科学院 果树科学研究所，熊岳115214；3石家庄经济学院商学院，石家庄050031) 摘要 以李品种杏李和甜李为试材，研究了PCR反应体系的主要成分及退火温 度对李RAPD扩增结果的影响。结果表明：在20弘l的反应体系中，模板DNA含 量对扩增结果影响不大，在10--一80ng均能得到较好的扩增；dNTP用量对扩增无 Taq酶在1．5U～2．0U均能得到好的扩增条带；退火温度在36℃得到清晰的条带。 关键词 李；RAPD标记；反应体系；优化 物。我国是李的起源地之一，李在我国的栽培历史十分悠久，种质资源极其丰富。 RAPD标记(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)，随机扩增多态性DNA，是以 简便，不需预先知道目的DNA序列，引物具有通用性，灵敏方便，多态性强，模板DNA 用量也少(ng级)，成本低；而且避免了使用放射性同位素，因而近年来在果树品种资源鉴 定方面得到了广泛的应用。特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面。 应用RAPD技术对李种质资源比较系统的研究，迄今未见相关报道。本研究对李 RAPD反应体系和条件进行了优化，以期为李品种指纹图谱的构建提供技术支持。 1 实验材料与方法 1．1 实验材料 供试材料为李属植物8个种及的i08份材料，条件优化选取其中杏李和甜李两份材料。 材料均取自辽宁省果树研究所熊岳国家李杏种质资源圃。采样时均采取枝条幼叶，液氮速冻 后置于一70℃冰箱保存。 1．2基因组DNA的提取 基因组DNA提取采取2×CTAB法：取0．19左右速冻叶片于1．5mlEppendorf管中， NaCl，100mM 加液氮用特制研棒研磨至粉状，加650弘1提取缓冲液(2％CTAB，1．4m Tris-HCl，20mM 次；取出冰浴5rain，加等体积氯仿：异戊醇(24：1，V／V)，混匀后12000rpm下4℃离心 · 】76· 植物生理与分子生物学 加等体积的氯仿。异戊醇再抽提一次；取上清液加2倍体积冰乙醇使DNA絮状沉淀生成， 量和浓度检测在紫外分光光度计上进行。用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。 1．3 PCR扩增条件及电泳 mM mM MgS04，100 PCR反应参照Martins的方法[6]：总体积201．I，10×buffer[20 mM KCl，80mM(NH4)2S04，100 Tris-HCl，0．5％NP一40，pH9．03 2t,1，DNA模板 20ng，引物浓度0．21．M，dNTP 72℃，2min；循环45次；后延伸72℃。 色，紫外投射仪照相。利用优化好的扩增条件，对RAPD引物进行筛选，选择条带清晰， 分辨率高，多态性好的作为再对李的108个材料进行扩增。电泳结果的每条DNA谱带为1 个单位，同一位点上有带的赋值为1，无带的赋值为0，统计结果以1，0矩阵输入计算机， 用NTSYSps软件处理数据，并对材料进行聚类分析。 1．4 PCR反应体系的优化设计 以PCR反应条件来讲，主要包括反应体系组成和热循环状态。而反应体系中DNA模 板量是首先要考虑的因素，其次是加酶量、M矿+浓度和引物浓度；热循环条件中则主要考 、 虑退火温度对扩增的影响。 2结果与分析 2．1 RAPD反应体系的优化 2．1．1不同DNA模板对RAPD反应的影响由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物决 定，模板DNA不需要高度纯化，但应避免任何