基于核酸的重大疾病诊断新策略和新技术研究.doc

项目名称： 基于核酸的重大疾病诊断新策略和新技术研究 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 教育部  1. 拟解决的关键科学问题 本项目拟解决以下三个科学问题： (1) 研究癌基因、DNA甲基化基因和突变基因的结构和生物学规律，比较它们在疾病和正常细胞中的差异。 (2) 解决核酸探针在疾病诊断中的特异性问题，设计、合成和筛选能特异性识别疾病基因靶点和多位点突变基因的探针分子。 (3) 核酸适配子的高选择性灵敏诊断问题。通过化学方法修饰核苷序列或碱基而形成的结构多样性核酸适配子对肿瘤标志物和CTC特异性的识别可以大大提高，从而提高肿瘤疾病检测的灵敏度。2．主要研究内容： 围绕上述三个科学问题，我们将开展如下几个方面的研究： 2.1 致病基因结构与生物学功能研究 核酸分子的生物学功能由其性质、结构和它们与其它生物大分子的相互作用所决定。以富G核酸的特殊性质为基础，建立模拟基因组DNA复杂结构下G-四链体结构和构象的解析、示踪和干预的新技术，筛选和鉴定与富G核酸、G-四链体相互作用的小分子。发展上述过程的干预手段，为重要疾病提供诊断和治疗的理论基础。 (1) 研究生理条件下富G核酸和G-四链体等高级结构的形成条件，以及表现出与疾病相关的性质。 (2) 发展解析生理条件下富G核酸和G-四链体等高级结构构象的技术，为研究小分子探针与富G核酸和G-四链体的相互作用提供技术支撑。 (3) 筛选、鉴定与富G核酸和G-四链体相互作用的化学小分子，研究小分子在生理条件下与富G核酸和G-四链体的相互作用、选择性识别及其生物学功能，为疾病诊断和治疗提供理论基础。 (4) 富G核酸结构损伤检测与损伤识别修复机制，认识致病核酸的结构，寻找与疾病相关的核酸序列。 2.2 针对致病基因的高灵敏、特异性小分子的设计与合成 针对癌基因、甲基化DNA、不规则核酸序列等致病基因的一级、二级和三级结构的特点，研究化学小分子与它们之间的相互作用，筛选出结合能力强、选择性高的化学小分子： (1) 以富含G 核酸序列为靶点（例如，VEGF、BCL-2、Ki-ras 癌基因启动子区和端粒DNA 富G 序列），设计合成和筛选具有识别功能的新型识别分子, 如： 氧氮杂环类大环和新型环状寡聚酰胺。在分子、细胞和动物水平上研究识别分子对上述癌基因启动子区G-四链体识别的特性和功能。 (2) 针对DNA 甲基化的基因靶点，主要是寻找能直接与甲基发生化学反应的小分子，可以达到识别DNA 甲基化的基因序列的目的。 2.3 分子探针对癌基因、甲基化DNA 和致病基因的识别与调控 (1) 以癌基因、突变基因和不规则核酸结构为靶点，基于化合物的特征性结构， 研究小分子配体与特殊核酸结构的亲和作用，设计筛选出对致病基因序列具有特异的高亲和性化合物，进行光、电、色等功能化基团修饰制备分子探针；在分子水平上理解其作用机制，揭示小分子-核酸间的结构功能关系，在分子水平上理解其相互作用的特异性。结合细胞生物学，研究病变细胞和正常细胞修饰电极对特定探针的响应及响应的异同点。 (2) 在得到设计合成的探针后，针对DNA 甲基化的基因靶点，利用现有小分子的光或电或色响应等性质，直接与相关的DNA 甲基化序列作用，通过相关的响应来检测DNA 甲基化序列. 在细胞水平上， 我们可以通过利用DNA 微阵列技术和PCR 技术分析合成的探针分子处理细胞前后基因表达的差异变化，从而发现探针的作用靶基因。利用甲基化PCR 以及bisulfite sequencing 分析这些基因启动子区域甲基化水平的变化，研究探针分子对DNA 甲基化基因的影响。2.4 对乳腺癌、肝癌识别的核酸适配子的设计与筛选 (1) 利用SELEX 技术自主筛选到的、能特异性结合乳腺癌、肝癌标志物或CTC 的小分子核酸适配子，将核酸适配子与具有光、电、色特征的小分子通过化学方法连接，建立乳腺癌、肝癌分子诊断新技术。 本研究将采用的CS-SELEX（Cell surface-SELEX）技术是将肿瘤细胞作为筛选介质的一种新型SELEX筛选方法，例如我们将表达多天线的复杂型N-糖苷的肿瘤特异性抗原靶分子的乳腺癌细胞并作为阳性正筛细胞获得靶分子，没有表达靶分子的同系细胞作为阴性反筛细胞消除非靶分子，获得特异性针对乳腺癌肿瘤细胞特异性抗原靶分子的适配子。通过化学计算、分子模拟和分子设计，进行适配子与靶分子对接分析与自适应识别研究，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、设计新的核酸适配子分子探针。 (2) 为了解决目前核酸适配子（DNA和RNA）的结构稳定性和特异性，我们将对筛选到的寡核苷酸结构进行化学修饰，主要在下面几个方面开展相关工作： 针对RNA目前面临的主要问题开展RNA或DNA化学修饰、体内