正交法研究光合细菌计数培养基.docVIP

正交法研究光合细菌计数培养基 摘 要:利用正交设计试验法研究了碳源、酵母膏、微量元素、磷酸盐、铁盐、琼脂等6个因子对光合细菌培养计数的影响,确定了各因素的最佳配比,其结果是:NaHCO31.0g,CH3COONa 3.0g,酵母膏2.0g,微量元素0ml/L,K2HPO40.5g,Fe-EDTA 0.005g,琼脂8g。该组合加上NH4Cl 1.0g,MgCl2.6H2O 0.2g,NaCl5.0g,dH2O 1000mL,即得出光合细菌计数培养基,称之为R培养基。该培养基对光合细菌的检测具有准确、快速、简便等优点。 关键词:光合细菌;培养基;正交法 1 前言 光合细菌(Photosynthetic Bacteria,简称PSB)是一 大类能进行不产氧光合作用的细菌,由于它具有能利 用有机小分子作为碳源的生理特性,且菌体本身又无 毒无害、营养丰富的特点,因而在水产养殖、废水处理 等行业中得到了广泛应用,并在新能源开发、种植业、 食品、化妆品、医药保健等行业显示出广阔的应用前 景[1,2],特别是在水产养殖方面,随着可持续发展理 念的兴起,光合细菌在水产健康养殖中扮演着越来越 重要的角色,并正进入了一个快速发展阶段。但是由 于缺乏统一的检测方法,光合细菌的主要指标,即活 菌密度一直无从准确测定,致使光合细菌制剂至今还 没有国家标准,由此造成光合细菌市场鱼龙混杂,反 而成为水产养殖及环境生态的一大隐患。 目前,有关光合细菌的重点仍在菌种的分离、培 养及其应用技术的研究,研究中对光合细菌培养量的 评估,基本上是采用光电比色法或显微直接计数法。 由于市售光合细菌制剂存在菌种复合、杂菌污染、培 养基质干扰以及色素掺假等问题,上述两种方法显然 不够准确,光合细菌的准确计数必须通过菌落计数来 确定。然而目前这方面的报道还很少,仅见孙军德等 人[3]作了光合细菌双层平板计数法的研究,而该报道 只是针对实验室某一纯培养物的研究结果,还难以推 广应用。 本文采用正交法研究出光合细菌的计数培养基, 即R培养基,经验证,该培养基对光合细菌的检测具 有专一性和特异性,而且快速简便,在实际应用中效 果良好。 2 材料与方法 2.1 试验材料 光合细菌菌种:沼泽红假单胞菌(Rhodopseu- domonas palustris)、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroids)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsu- late)混合培养物,由华东师范大学环境科学研究所提 供,浑球红假单胞菌RS601 (Rhodopseudomonas spheroids)由中科院上海植物生理研究所提供,红球菌 AB96026(Rhodococcus sp.)由中国典型培养物保藏中 心提供。 其他菌种:桔橙色动球菌AA98005(Kineococcus aurantiacus)、桔橙小单胞菌AA95041(Micromonospora aurantiaca)、深红酵母AY91005(Rhodotorula rubra)、红 酵母AY93148 (Rhodotorula sp.)、金黄色葡萄球菌 AB91053(Staphylococcus aureus)、大肠埃希氏杆菌 AB90054(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌AB94007 (Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌AB200058 (Shigella dysenteriae)由中国典型培养物保藏中心提 供。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus)由本实验室从海水中分离并经 VITEK-AMS鉴定至种。 所用试剂均为分析纯。 2.2 方法 2.2.1 光合细菌培养条件的确定 参照文献[3~7],选择光合细菌的培养条件为:温 度28e~30e,光照强度3000Lx,培养72h,如果菌落 #45# 2004年 检验检疫科学 第14卷 第1期 *作者简介:刘军义(1966-),男,中科院武汉病毒研究所毕业,理学硕士,已发表论文15篇。表1 试验因子水平 因子水平 因子种类及其代号 A 碳源(g) B 酵母膏(g) C 微量元素贮液(mL) D 磷酸盐(g) E 铁盐(g) F 琼脂(g) 一水平NaHCO3 2.0 1.0 3 KH2PO4 0.5 0.2 8 二水平NaHCO3 4.0 1.5 5 K2HPO4 0.5 0.1 20 三水平NaHCO3 1.0CH3COONa 3.02.0 0.5 KH2PO4 0.25 0.025 5 四水平 NaHCO3 2.0 丁二酸钠 1.0