生化实验报告福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度.docVIP

实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度 实验目的 学会制备无蛋白血滤液。 掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。 掌握7200型可见分光光度计的使用方法。 二,实验原理 蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。 三.实验仪器 试管 移液管 卵清蛋白片 7220分光光度计 四. 实验试剂 1、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。 2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。 3、10%钨酸钠溶液： 称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。 4、0.33mol/LH2SO4溶液： 于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。 五.实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备： 用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。 再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。 2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。 六.数据处理 列1 空白管 标准管（A0） 样品管（A1） OD420 0 0.072 0.097 OD420 0 0.071 0.097 OD420 0 0.072 0.097 平均 0 0.072 0.097 按下式计算100ml全血中所含血糖的含量 m=A1/A0×C0÷0.1×100 式中: m=100ml全血中含血糖毫克数 ; C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml） A1=样品液光吸收值 ; A0=标准液光吸收值 0.1ml无蛋白血溶液相对于0.1ml全血 得出m=134.72mg 七.实验分析 一．提高实验准确度的措施？ 应尽可能把移取的血液完全放出，即等待挂在壁上的血液滴下后再进行接下来的操作。 若过滤后滤液浑浊不为无色透明，则应二次过滤。 尽量保证三只试管水浴时间相同。 二、实验中，血糖管有什么作用？ 由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，为减少Cu+与空气的接触，通过血糖管的细颈阻挡空气，防止形成Cu2+。 三.实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？ 使其尽快降温，防止高温使钼蓝氧化。