秸秆腐蚀剂实验方案.docVIP

秸秆腐熟剂的设计方案 秸秆腐蚀剂应该包括纤维素降解菌、木质素降解菌以及其它辅助菌。本试验方案就是紧紧围绕获得这三类高效菌以及作为一个整体具有良好应用价值的目的而设计的。 1高效纤维素降解菌 1.1高效绿色木霉的筛选 1.11试验材料：武汉合缘生物公司提供的绿色木霉样品 1.12培养基 分离培养基：察氏培养基 硝酸钠 3g 磷酸氢二钾 1g 七水硫酸镁 0.5g 氯化钾 0.5 硫酸亚铁 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 20g 链霉素终浓度25μg/ml 蒸馏水 1000ml 种子液培养基：200g马铃薯洗净去皮，切成小块，加l000ml水沸水煮lh，双层纱布过滤得到马铃薯汁，加2%葡萄糖，调节pH值至6.8，121℃、20min灭菌备用 液体发酵培养基：蛋白陈0.3%，硫酸铵0.2%，酵母膏0.05%，KH2PO4 0.4%，Cacl.2H2O 0.03%，MgSO4.7H2O 0.03%，TWeen-80 0.02%为基础培养基，添加1.5%的稻草粉即为发酵培养基，121℃、20mni灭菌备用 1.13试验步骤 1.131利用分离培养基对绿色木霉样品进行初步的筛选，得到绿色木霉单菌落，挑取生长良好的菌落进行复选，这样得到的微生物不含有其它的杂菌 1.132将上步得到的菌株接种于种子液培养基中 1.133内切β-葡聚糖苷酶测定。利用纤维素酶能够水解纤维素产生葡萄糖，以羧甲基纤维素钠为纤维素酶的作用底物，用还原糖的生成量表征内切β-葡聚糖苷酶活力，俗称CMC-Nase或CMC-Na酶活力。具体操作如下: 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液配制:根据所需缓冲液的不同pH要求，用0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸配制而成 CMC-Na溶液的配制:称取CMC-Na(羧甲基纤维素钠)1g，加入100mL水，水浴加热结合磁力搅拌使溶解，再加入pH5.0的磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液20mL，水40mL搅匀，浓度为0.00625g/ml。 内切β-葡聚糖苷酶活力的测定:取0.5mL稀释一定倍数的酶液，加入l.5mL配制好的CMC-Na溶液，于50℃保温30min，而后加入2mL10%氢氧化钠溶液终止反应，再加入3mLDNS试剂，沸水浴15min，自然冷却后在550nm处测定样品的吸光度。样品的参比液为:同一酶液先加入2mL10%氢氧化钠将酶灭活，然后再加入底物，其余操作同上。 运用回归分析法，得到酶活力大小。具体如下：将测量得到的数据代入由标准曲线测量值计算出的回归方程，再由回归方程计算出相应的被测样品所含还原糖量，根据酶活力单位定义计算出酶活力大小。 1.134外切β-葡聚糖苷酶活力的测定 用pH5.0的Na2HPO4一柠檬酸缓冲液配制浓度为1g/100ml的微晶纤维素溶液，取该溶液0.5ml并加入0.5ml酶液，30℃震荡(200r/min)20h，其它同内切β-葡聚糖酶活力的测定。 1.135若上步酶活太低，可以再从野外采样，筛选酶活高的菌株 1.136若获得菌株仍不理想，可以诱变菌株 绿色木霉→斜面复活→紫外线诱变→恒温暗培养→挑选菌落接种斜面→初筛→摇床发酵→酶活力测定→筛选出一株酶活力较高的菌株(诱变菌株) UV+亚硝酸钠诱变→恒温培养→挑选菌落接种斜面→摇床发酵→酶活力测定→选出一株酶活力较高的菌株(复合诱变菌株) UV+NaNO2+硫酸二乙酯诱变→恒温培养→挑选菌落接种斜面→选出的菌株和诱变菌株比较→传代实验选取稳定的变异菌株→保种传代实验选取稳定的变异菌株→保种 1.2高效黑曲霉的筛选 1.21试验材料：武汉合缘生物公司提供的黑曲霉样品 1.22培养基 （同1.12） 1.23试验步骤 1.231（同1.131） 1.232（同1.132） 1.233β-葡萄糖苷酶活力的测定 用pH5.0的Na2HPO4一柠檬酸缓冲液配制浓度为1g/100ml的水杨素溶液，取该溶液1.0ml并加入1.0ml酶液，50℃反应30min，其它同内切β-葡聚糖苷酶活力的测定。 1.235（同1.135） 1.236（1.236） 2高效木质素降解菌 2.1材料来源：野外采样 2.2培养基 PDA 综合培养基:马铃薯提取液1 000 ml 、葡萄糖20 g、KH2 PO4 3. 0 g、MgSO4 ·H2O 1. 5 g、维生素B1 微量、琼脂15. 0 g。 选择性培养基:俞创木酚1. 0 g ,酒石酸铵0. 1 g ,蛋白胨2. 6 g ,MgSO4·7H2O 0. 5 g ,KH2 PO4 1. 0 g ,Na2HPO4 0. 2 g ,琼脂18 g ,加蒸馏水至1 000 ml 。 PDA —Bavendamm 培养基:在PDA 培养基中加入鞣酸至终浓度为0. 01/ 100ml 。 PDA —RB 亮