蔗糖酶的分离提纯.docVIP

蔗糖酶的分离提纯 【实验目的】 1．了解蔗糖酶分离提纯的方法。 2．掌握层析技术。 蔗糖酶[Ec 3．2．1．26]习惯命名--D--Fructofuranosidase系统命名：--D—Fructofuranosideffructonydrolase。 蔗糖酶是一种水解酶，能使蔗糖水解为果糖和葡萄糖。它所催化的反应是： H OH OH H 蔗糖 + H OH OH H 葡萄糖 果糖 蔗糖酶的分布相当广，在微生物、植物及动物中都有它的存在。在微生物中，酵母中的含 我们实验室的研究表明自溶法破碎酵母细胞，采用乙醇分级和DEAE--纤维素柱从酵母中制备蔗糖酶，材料来源十分方便，而且以自己提纯的酶制剂进行蔗糖酶的性(1)0．2％葡萄糖标准液(2)3，5二硝基水杨酸试剂(3)新鲜啤酒酵母(4)甲苯(5)乙酸钠(6)稀乙酸溶液(7)95％乙醇(8)DEAE--纤维素(9)0.5mol／L NaOH(10)0.5mol／L Hl；(11)0.005mol／L，pH60的磷酸钠缓冲液(12)含O15mol／L NaCl的O005mol／L，pH60的磷酸钠缓冲液 (13)5％蔗糖(14)测定蛋白质浓度试剂(15)聚丙烯酰胺凝胶 2．仪器 (1)恒温水浴(2)烧杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒(3)冰盐浴 (4)离心机(5)721型分光光度计(6)柱层析装置(7)天平；(8)pH计 (9)滴管、试管和血糖管(10)秒表 一、葡萄糖浓度标准曲线的制作 1取1支血糖管，按下表加入0．2％葡萄糖溶液、水及3，5一二硝基水杨酸试剂：N0 含糖量 (mg) O．2％葡萄糖 标准液(mL) 水 (mL) 3,5--二硝基水杨 酸试剂(mL) OD540 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 上述试剂混匀后，在沸水浴中加热5min，取出立即冷却，以蒸馏水稀释至25mL，摇540nm测光密度。 ．以葡萄糖含量(g)为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。 二、蔗糖酶的分离提纯 1．蔗糖酶粗品的制备 (1)自溶 称取0克酵母，放在20mL的烧杯中，蒸馏再加入15克乙酸钠。然后在35℃水浴中搅拌30min，此时会观察到菌体自溶的现象。 (2)提取及粗酶的制备 往上述自溶液中加60mL蒸馏水，将烧杯用表面皿或玻璃纸盖好，于35℃保温过夜。第二4500r／min离心20in。取出离心管，得到的 量出粗酶液体积，记录。取2mL作为待测活力和蛋白浓度的样品℃保。 2．乙醇分级 将粗酶液用稀醋酸调pH至45。 (1)32％乙醇饱和度 按下面的公式算出使粗酶液的乙醇浓度达32％时所需乙醇体积。 X/（V+X1）O.32 式中X1为所需乙醇体积，V为粗酶液的体积。然后再按X／095换算出使乙醇浓度(按体积)32％时所需95％乙醇的体积。 把粗酶液和量好体积的95％乙醇在冰盐浴中预冷(0～2℃)。小心缓慢滴加乙醇，同时不 在滴加乙醇过程中，酶液渐渐变混浊，滴加结束后，于3000r／min离心5min。上清转移到 (2)47.5％的乙醇饱和度 按下式算出使酶液乙醇浓度达47．5％时所需乙醇的量 X/(V+X2)=0.475 式中X2为所需乙醇体积，V为粗酶体积。再按X／095算出需95％乙醇的体积。按下式可算47．5％时所需补加的95％乙醇体积。 X/0.95- X1/0.95=使乙醇浓度达47．5％时需补加的95％乙醇体积 按前述方法，继续补加乙醇，使乙醇浓度达47.5％于3000r／min离心3min，弃去上清会得10mL pH6.0的0.005mol／L磷酸钠缓冲液溶解，并对该液透析过夜或酌 量出酶液体积，取出2mL，待测活力和蛋白浓度。其他酶液准备上柱。 3．DEAE一纤维素柱层析 (1)DEAE一纤维素处理 在使用前，将市售的DEAE一纤维素按下述方法处理：用去离子水浸泡过夜，用浮选法除30min沉积部分，重复几次。然后用0.5mol／L NaOH，水，0.5mol／L HCl，水，0.5mol／L NaOH，水，交替浸泡。其中NaOH浸泡2～4小时，HCl浸泡半小时，每次抽滤后用