细胞培养中支原体PCR检测方法建立及应用.pdfVIP

第四届中国兽药大会——兽医微生物学、兽医生物制品学学术论坛论文集(2012年) 细胞培养中支原体PCR检测方法建立及应用 张贵刚，郭伟，刘国英 000) (金宇保灵生物药品有限公司动物疫苗国家工程实验室内蒙古呼和浩特111 摘要：本研究建立了针对细胞培养中支原体PCR检测的方法，并将其应用到细胞液和细胞培养用血清等样品的支原体 检测中，为培养细胞、动物疫苗及生物制品污染支原体的检测提供帮助。 细胞是兽医生物制品领域科研和生产的重要工具，细胞培养的人用、禽用和畜用病毒性疫苗不断增加， 产生单克隆抗休的杂交瘤细胞也来自动物骨髓瘤细胞与脾细胞的融合u。。然而各种细胞培养物感染支原体是 ㈦11。细胞被支原体污染后，不引起明显的细胞形态改变，也不导致液体混浊，仅凭外观难以发现，但被污 染的细胞却可产生一系列生物学变化，包括生长特征、病毒产量下降等，给科研和生产带来了严重的损失， 因此建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要。 支原体检测方法中，传统培养法检测需时一个月，荧光法需时l周，这样的检测方法都难于应用到细 胞培养及疫苗生产工作之中。PCR检测方法已经成为一种常用的有效检测微生物的方法，无论是测时长、特 异性和灵敏度三方面都是较优秀，尤其适用于象支原体这类培养困难的细菌检测鉴定隋’81。本研究建立了针 对于细胞培养中各环节的支原体PCR检测方法，使之可以应用到细胞培养及疫苗生产工作之中，可以用于 检测细胞培养用血清，细胞培养液等，希望本方法的建立能够对培养细胞、动物疫苗及生物制品污染支原 体的检测有所帮助。 1材料与方法 1．1 材料 1．1．1 菌种及细胞支原体阳性对照，来源本公司QC部细菌检测室，购自中监所。BHK、VERO细胞培养液 来源自本公司生产部，种细胞由本室保存。 1．1．2 试剂与仪器Promega公司GoTaq 仪，电泳槽。 1．2方法 1．2．1支原体PCR检测引物设计根据目前已发表的50种余种支原体的16SrRNA区域的全长序列及部分 种别的23SrPdNA序列旧1 0|，通过基因序列的比较选择不同种支原体中所共有的保守序列进行引物的设计。 共设计4对简并引物，优选1对用于检测方法建立，引物序列如表1所示。 表1PCR用引物信息 引物序号 引物序列(5’．3’) UP：ACACCATGGGAGCTGGTAAT 引物l DN：CTTCATCGACTTCCAGACCC UP：ACACCATGGGAGCTGGTAAT 引物2 DN：ACCCAAGGCATCCACCAAAT UP：GGCAGGACTGATGACTGG 引物3 DN：CTCGCTAATTTGACTATGGATT UP：ACACCGCCCGTACACCAT 引物4 DN：ACCCAAGGCATCCACCAA ‘·__——242‘___—— 1．2．2支原体检测阳性对照制备阳性对照支原体，按生物制品规程常规培养法培养。液体培养基增菌后， 分装成200ul／管于一20℃冻存备用。 1．2．3支原体基因组DNA的制备支原体培养物、细胞培养物和血清等样品液均按如下方法处理。 将1ⅢL样品液12000 12000 rpm／min离心5min，取上清存于-20备用，用做PCR检测模板。 1．2．4支原体PCR检测体系构成PCR检测反应体系25ul，按如下