基因打靶技术及其应用前景.docVIP

基因打靶技术及其应用前景 摘要：基因打靶是近年来发展起来的对细胞基因组中的某一基因进行定点操作的生物技术。综述了基因打靶的筛选系统，影响基因打靶效率的几个主要因素及其解决方法，总结了基因打靶在各个学科领域中的应用。 ????基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体 DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法。它产生于70年代末和80年代初，最初应用于酵母细胞，80年代中期应用于培养的哺乳动物细胞。此后，科学家将此技术与胚胎干细胞操作技术相结合，使其得到迅猛的发展，并在生物学、医学和畜牧学等学科领域的研究和应用中展现出广阔的前景。 ????基因打靶的原理和技术路线虽不复杂，但是，由于高等真核生物细胞内外源DNA与靶细胞DNA 序列发生同源重组的机率非常低，所以要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来将是一种非常困难的工作，所以，筛选和富集中靶细胞就成为基因打靶技术中的关键一环。 ????基因打靶筛选系统 ????选择标记基因定点突变的筛选 ????以犹它大学Capecchi教授的实验为例，介绍选择标记基因定点突变的筛选方法。首先，在HPrt 序列的第8外显子处插入一个新霉素抗性基因（neor）作为选择标记，然后用电击转移法将打靶载体导人ES细胞中，通过G418和6-TG（6- thioguanine，6-巯基鸟嘌呤）两种药物的双筛选，得到了既抗G418又抗6-TG的细胞克隆。从理论上推测，这些细胞克隆都应是对靶细胞Hprt基因进行了定点突变的克隆，因为如果外源基因没整合入靶细胞基因组，靶细胞（Neo--/Hprt+）在G418和6- TG的任何一种选择培养基中都将全部死亡；如果打靶载体只是随机整合入靶细胞基因组，则该 Neo+/Hprt+细胞在6-TG选择液中将全部死亡。所以，只有通过同源重组，使Hprt位点发生了定点突变的克隆（Neo+/Hprt-）才能在两种选择培养基都存在的情况下存活。 ????正向选择法（positive lection） ????正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。其原理是，构建一个特殊的载体，此载体所携带的正向选择标记基因本身没有自己的表达调控因子而只能利用靶位点上相应的表达调控元件来启动表达，从而发挥选择标记的作用。根据所用的表达调控元件的不同，此法又可分为无启动子筛选法和无Poly（A）筛选法。 ????无启动子筛选法（promoterless selection）将无启动子的Neor基因插入靶载体中，当该载体转化细胞后，可能出现以下几种情况（1）靶载体未整合入细胞基因组而随传代消失；（2）随机整合，整合位点旁侧序列无启动子，Neor基因不表达；（3）随机整合，整合位点附近存在其它基因的启动子，启动 Neor基因表达；（4）同源重组，Neor基因借助靶序列中自然存在的启动子活跃表达；因此，G418抗性细胞应具有后两种整合事件。根据它们所产生的 DNA酶切图谱的不同可用Southern印迹法予以区别。Neor基因可以以两种方式插入载体目的基因片段中，或者以一致的阅读框插入目的基因片段，或者在Neor基因翻译起始位点5’上游引入翻译终止码。前者将在靶基因启动子的启动下，表达Neor基因的融合蛋白，使转化细胞具有G418抗性，后者则通过核糖体重启动或翻译起始表达独立的 Neor基因产物，转化细胞将同样获得G418抗性表型。 ????采用无启动子筛选法，Charron等定点突变了小鼠ES细胞N-myc基因，Schwartzberg等用此法成功筛选出ES细胞c-abl基因突变克隆。 ????无Poly（A）筛选法（polyA-Less selection）无Poly（A）的打靶载体设计与无启动于载体相似，所不同的是，在无Poly（A）筛选法中，正向标记基因的表达要依赖于polyA的存在与否。在前两种情况下，由于缺失polyA信号， Neor基因的表达在转录水平上受到限制，因此细胞不能有效产生G-418 抗性；后两种情况下，Neor基因利用polyA信号得到有效表达，从而使靶细胞具有G-418抗性。然后再用Southern印迹法鉴定出真正发生同源重组的克隆。 ????Joyner等在鼠ES细胞En-2基因的定点突变中采用无poly（A）筛选法，获得的同源重组与非同源重组比率为1：260。 ????正负筛选法（positive and negtive selection） ????正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Ncor基因作为正选择标记；在同循序列之外的3’末端，或3’，5’两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）基因的序列作为负筛选标记。经酶切后