实验九紫外吸收法测定核酸的含量.pptVIP

实验九 紫外吸收法测定核酸的含量  一、实验目的 1、通过实验，了解紫外线（UV）吸收法测定 核酸浓度的原理。 2、进一步熟悉紫外分光光度计的使用方法。 二、实验原理 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶具有共轭双键系统，使其在240~290nm的紫外区具有强烈吸收峰，其吸收高峰在260nm处。 核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用ε（P）来表示。ε（P）为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。 核酸摩尔消光系数及相应光吸收值 ———————————————————————————————— ε(P) 含磷量/(%) A260nm pH7，260nm 1μg/mL RNA 7700-7800 9.5 0.022-0.024 DNA-Na盐 6600 9.2 0.02 （小牛胸腺） ————————————————————————————————-- 蛋白质也能吸收紫外光,通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。可通过检测样品的A260/A280,检测样品的纯度： 一般来说，纯的RNA在260nm与280nm吸收的比值〉2.0；纯DNA在260nm与280nm吸收的比值则在1.8左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降，260nm与280nm吸收的比低于1.8。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。 三、实验器材 分析天平，紫外分光光度计，烧杯，溶量瓶（50ml）， 吸量管，试管及试管架 四、实验试剂和材料 1、试剂 5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍； 0.01mol/LNaOH 2、测试样品 RNA或DNA制品。 五、实验操作 1. 准确称取从植物中提取的核酸粗品的质量， 加少量0.01mol/L NaOH调成糊状，使其充分 溶解，再加适量水，加水量至总体积在2~3ml, 用5-6%氨水调至pH7.0-8.0作为母液。 2. 用移液管取1ml母液至试管中稀释，稀释倍 数视样品浓度而定，使A值在0.5~1.0之间。 3. 选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm和 280nm波长处分别测定A值，据经验公式计算核酸 含量。 六、计算： ε(P)=A260/(C.L) RNA浓度（μg/ml）= A260/0.024xL ×N DNA浓度（μg/ml）=A260/0.020xL ×N 式中，A260——260nm波长处光吸收读数； L——比色杯的厚度，1cm； N——稀释倍数； 0.024——每毫升溶液内含1μg RNA的A值； 0.020——每毫升溶液内含1μgDNA钠盐的A值。 核酸%= （1ml 待测液中测得的核酸微克数/1ml 待测液中制品 的微克数）×100% 七、思考题 1、干扰本实验的物质有哪些？ 2、设计排除这些干扰的实验。 * * *