实验十二DNA的酶切检测及重组载体构建.docVIP

实验十二 DNA的酶切检测及重组载体构建 一、实验目的： 学习 DNA 的酶切、纯化及外源片段与载体的连接。 二、实验原理： 1、限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经酶切的DNA 纯化处理后用于连接反应； 2、选择克隆载体 多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连； 3、在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。 三、实验材料： 酶切质粒载体和目的基因： 　DNA 5μl 酶切缓冲液 μl ddH2O 3μl EcoRI酶 1μl（2U） 总体积 10μl 373h，加凝胶上样缓冲液（6X）2μl， 电泳(:2h)。分析质粒DNA的限制性酶切图谱。 四、实验步骤： DNA分子的体外连接，在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： a. 0.1μg质粒载体，2倍分子的外源ＤＮＡ。 b. 加无菌水至7.5μl，于45℃加温５分钟使重新退火的粘端解链， 将混合物冷却到。 c. 10×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl Ｔ４ＤＮＡ连接酶 0.1μl 5mM ATP 1μl 盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒，12℃下过夜连接反应。反应结束后于－20℃保存。 附注： 1、根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。 2、克隆中用到的几种工具酶： （ 1 ）限制性内切酶 限制性内切酶的一个活性单位（ 1U ）：指在 50 μl 反应体系中， 37 ℃下，经过 1 小时的反应将 1μg DNA 完全切割所需要的酶量。 限制性内切酶的 star DNA 切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定 DNA 序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的 star 活性。它的出现与限制酶、底物 DNA 以及反应条件有关。 （ 2 ）碱性磷酸酶 细菌碱性磷酸酶（ BAP CIAP ）都能催化水解 DNA 、 RNA 、 dNTP 和 NTP 上的 5 －磷酸残基。比较而言， CIAP 更常用，因其可在 70 ℃ 10 内加热灭活或通过苯酚抽提而变性失活，同时 CIAP 的活性比 BAP 的高 10 － 20 倍。它主要用于：（ 1 ）克隆时去除载体的 5-P ，以防载体自连；（ 2 ）在用 Kinase 进行 5 末端标记前，去除 DNA 的 5-P 。 （ 3 ）连接酶 体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和T4T4噬菌体连接酶都是首选的酶，因其在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。