高免血清的制备及效价测定.docVIP

高免血清的制备及效价测定 目的意义 1、 2、学习家兔采血的方法和血清、学习琼脂双向扩散法检测血清效价B淋巴细胞，B淋巴细胞增殖、分化形成浆细胞，浆细胞分泌产生特异性抗体。（示意图）该特异性抗体与相应抗原在电解质存在的情况下，在琼脂凝胶中相对扩散，相遇时结合形成肉眼可见的抗原抗体复合物，由于复合物分子较大，不能继续扩散，所以在琼脂凝胶中沉淀下来，形成肉眼可见的沉淀线。此法可鉴定所制备的高免血清的特异性，并检测出其效价。（示意图）。 实验材料 实验动物：健康成年家兔，体重1.5-2.0Kg； 药品：沙门氏菌油乳剂灭活苗（自制）；消毒酒精及碘酒；琼脂粉；硫柳汞、NaCL等； 器械：剪刀、镊子、止血钳、三角瓶、平皿、打孔器等。 操作步骤 1、家兔的免疫 在家兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射含有完全佐剂的抗原0.1ml，抗原含量5mg/ml初次免疫；待两侧腹股沟淋巴结肿胀后注射含有完全佐剂的抗原0.1ml， 7-10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各2点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.5ml；7-10天后脊柱两侧重复注射1次；7-10天后试血，不合格者重复脊柱两侧注射。 2、琼脂扩散平板的制备 称取一定量的琼脂按1%左右的比例加入生理盐水，加热煮沸充分溶解，稍冷后加入终浓度1/万的硫柳汞混匀，将上述溶液倒入平皿中，厚度约为2-3mm，待凝固后用打孔器在其上打中间一孔，周围六孔的梅花形孔，孔径为2mm，孔间距3-4mm，挑出孔内琼脂，注意不要挑破琼脂边缘，然后在酒精灯火焰上缓缓加热，使孔底少量琼脂溶化封住孔底。 3、试血 取耳缘静脉血待凝固后分离血清，用生理盐水将血清作2倍系列稀释后加入梅花形孔周围孔，中间孔滴加抗原，以加满为宜，加毕后，盖上皿盖，将平皿置湿盒中，37℃扩散24-48小时，观察结果。 4、免疫家兔的采血 方法有颈动脉放血和心脏采血。颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露出颈动脉并分离与颈动脉伴行的迷走神经，远心端用止血钳夹住，近心端用止血钳夹住约1/3，两止血钳间间隔约2-3cm。斜剪断近心端血管，血液导入灭菌三角瓶中，放血过程中要严格按无菌要求进行。 5、高免血清的分离 收集的上述血液置室温下约1h左右待凝固后，置4℃过夜析出血清后，再无菌分离血清。 血清物理性状检查 观察血清是否清亮、透明以及颜色，是否有溶血等。 结果分析 记录本组家兔采血的方法以及血清分离效果。 简述琼脂扩散试验的注意事项及结果。 思考练习 制备高免血清时，是不是免疫次数越多越好。 琼脂扩散试验检出的是凝集抗体吗？ 琼脂平板中加硫柳汞等防腐剂有何作用？