布鲁菌病多重PCR快速检测方法的建立及应用.pdfVIP

动物医学进展．2010，31(S)：5-9 in Medicine ProgressVeterinary 布鲁茵病多重PCR快速检测方法的建立及应用 王晶钰，张三东，刘红彦，李河林，程媛媛，李宇立，战美娜 (西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵712100) 种病原，各设计合成了一对特异性引物，通过优化引物浓度组合，建立了检测布鲁茵472bp、290bp、162bp 片段的多重PCR快速检测方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性试验，结果显示，该方法从布鲁茵 标准菌株中扩增出了特异性的目的片段，而对大肠埃希茵等细菌的扩增结果均为阴性。经过对10倍倍比稀 标本中最低可检出细茵数为80cfu／mL。不同人员用该方法重复检测，结果均一致，表明重复性好。应用该 方法对88份临床疑似布鲁茵感染的奶牛乳样进行了检测，结果检出17份阳性，阳性检出率约为19．3％。 检测结果表明，该方法具有特异、敏感、重复性好等优点，可用于奶牛布鲁茵病的临床检测及流行病学监测 等。 关键词：布鲁茵；外膜蛋白基因；多重PCR；检测 中图分类号：QS852．614 文献标识码：A 法对病原进行鉴别分析，现已成为实验室布鲁菌检 布鲁茵病是由布鲁菌(Brucella)引起的人畜共 患传染病，该病广泛分布于世界各地，在许多国家有 测的首选方法m]。本研究选择布鲁菌基因组中保 不同程度的流行，尤其是在发展中国家，严重危害经 济发展和公共健康。现已确定的布鲁茵有6个种属 基因，各设计了一对特异性引物，分别进行特异性、 和20个生物型[1]。布鲁菌感染动物表现为睾丸炎、敏感性、重复性试验及应用研究，最后建立起布鲁菌 流产、不孕不育；人类主要表现为关节炎、神经损伤 的多重PCR检测方法，可以弥补因为某一种基因发 及各种组织的局部病灶[2]。该病在家畜中以牛、羊、 生变异而使单重PCR检测出现的假阴性。希望对 猪最常见发生。布鲁菌对奶牛业的危害巨大，奶牛 布鲁菌流行病学的监测、实验室检测和诊断提供一 主要感染牛种布鲁菌，同时也可感染羊种布鲁菌和 定的技术依据。 猪种布鲁菌，是引起奶牛流产的主要病因之一[3]。 1材料与方法 流产母畜是最危险的传染源，病菌存在于流产的胎 1．1菌株 儿、胎衣、羊水及阴道分泌物中；病畜的乳汁或精液 布鲁菌S2株，购自中国农业科学院兰州兽医研 中也有病菌存在，人若饮用了布鲁菌病病牛所产的 究所；大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、无乳链 生奶或与病畜密切接触会导致感染本病，对畜牧业 和人类公共健康造成严重威胁。 球菌、多杀性巴氏杆菌等均由本实验室保存。 布鲁菌病对各国畜牧业的危害巨大，国内外兽 1．2样品来源 医科研工作者相继建立了许多检测、诊断方法，包括 被检样品来自陕西省某奶牛场疑似布鲁菌病奶 细菌分离鉴定、试管凝集试验、酶联免疫吸附试验、 牛乳样88份。 血清中和试验、分子生物学技术等[‘]。而以PCR为1．3主要试剂 代表的分子生物学检测方法具有快速、特异及敏感 等诸多优点，加之可以通过引物设计、序列测定等方 DNA胶回收试剂盒均购自百泰克公司，质粒提取试 收稿日期：2010-03-21 05)资助 作者简介：王晶钰(1964一)。男，陕西乾县人，博士，副教授，主要从事动物性食品卫生学和善医公共卫生学方面的教学 和科研工作。 6 动物医学进展2010年第31卷增刊(总第202期) DNA Mix、Trans2000Marker、PMD- 剂盒、PC