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PLCγ-PKC信号转导通路与肿瘤淋巴道转移相关性研究 朱璨，林深，崔敏娟，冉丽洁，黄晓华，马克里 摘要：为阐明PLCγ1 /DAG/PKC信号转导通路对肿瘤转移调控的分子机理， 我们采用SDS、Western Blotting技术对具有不同淋巴结转移潜能的一对小 鼠腹水型肝癌细胞株PLCγ1 /DAG/PKC信号转导通路活性进行了比较分析。结果 显示，高转移细胞株Hca-F细胞，磷酸化PLCγ1和膜结合的PKCα、含量显著高于 低转移的Hca-P细胞。说明高转移的Hca-F细胞PLCγ1/DAG /PKC信号转通路活性 高。也提示PLCγ1/DAG /PKC信号转通路可能是影响两细胞株淋巴道转移能力主 要信号途经。 关键词： PLCγ 1；PKC；信号转导；肿瘤转移 浸润和转移是恶性肿瘤重要病理学特征及临床致死的主要原因。阐明其分子 机制，对发现药物靶点，筛选抗转移药物，抑制肿瘤转移及降低肿瘤患者死亡率 具有重要意义。肿瘤的浸润和转移是个复杂的过程，牵涉到肿瘤细胞遗传物质、 [1] 表面结构、侵袭力、粘附能力、血管新生等 。对其相关分子表达及功能调控的 研究是当今这一领域的重要研究课题。 已知磷脂酶Cγ1/二脂酰甘油/ 蛋白激酶C信号转导通路（PLCγ1 /DAG/PKC [2，3] signaling pathway）是细胞内调控肿瘤细胞侵袭和转移的重要信号途经之一 。 该信号通路的激活以PLCγ1、PKC活化、以及DAG水平升高为标志，其活化后参 与多种与肿瘤的浸润和转移有关的分子如一些酶、蛋白激酶、受体、离子通道、 细胞黏附分子和转录因子功能和表达的调控。从而对细胞增殖分化、癌变、凋亡 [4] 及细胞运动进行调控 。为探讨PLCγ1 /DAG/PKC信号转导通路对肿瘤经淋巴道 转移的调控机制，我们采用具有不同淋巴结转移能力的Hca-F （为高淋巴道转移 株，淋巴结转移率为80%）和Hca-P （为低淋巴道转移株，淋巴结转移率为0-20% ） 细胞株为模型，对两细胞株细胞PLCγ1 /DAG/PKC信号转导通路的活性进行了比 较。 材料和方法 一．材料 抗PLCγ1、Phospho- PLCγ1、PKCα、PKCβ1、PKCβ2 抗体、生物素化羊抗 兔IgG、碱性磷酸酶标记的链亲和素均购自美国Santa Cruz 公司。洋地黄皂甙购 自美国Sigma, 公司。 二．方法 1．细胞培养 Hca-F 细胞株和HCa-P 细胞株为同一来源但具有不同淋巴结转移能力的两 个细胞株。Hca-F 为高淋巴道转移株，淋巴结转移率为80%，Hca-P 为低淋巴道 [5] 转移株，淋巴结转移率为 0-20% 由本校病理教研室凌茂英教授建株 。细胞于 10%小牛血清的1640 培养基中，5%CO 培养。 2 ． 细胞的裂解及蛋白的提取 收集细胞。以生理盐水洗2次，得细胞压积约0.2ml 。加入1.0ml细胞裂解液 (PH7.4, 10mM PBS, 1mM EDTA, 2mM EGTA, 1%Triton100, 0.1%SDS, 1%蛋白酶 抑制剂) ，混匀后静止10分钟，10000rpm离心5分钟，收集上清即为细胞总蛋白。 用考马斯亮蓝法对细胞总蛋白进行定量。 3 ．Western blot 方法分析PLCγ1的磷酸化 取60μg细胞总蛋白进行SDS分离(浓缩胶4% ，分离胶7%)，电泳后以恒 2 定电流(1mA/cm )采取半干式转移电泳转膜，将蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF 膜于含3% BSA的封闭液中封闭2小时，然后相继与抗PLCγ1和抗p- PLCγ1的一抗 (1 ：400) ，生物素化的羊抗兔IgG或兔抗羊IgG(1 ：40