无创评估精子形态新技术%3a拉曼光谱扫描精子的初步的研究.pdfVIP

汇报时间：2011．12．1110：15—10：30 无创评估精子形态新技术：拉曼光谱扫描精子的初步研究 朱勇1刘锋1何琳2冯锡武1施文博1刘勇1胡洪亮1黄翼然1李铮1“嗵讯什舢。 (1上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海市男科学研究所精子发 育与遗传学实验室，上海市人类精子库，上海200001，2上海交通大学分析测试中 心，上海200001) 【摘要】拉曼光谱是由拉曼频移和谱峰强度构成的二维图像。通过分析物质 的拉曼光谱谱峰的位置、形状和强度，可以从分子水平上了解物质的构成、特性 及其变化规律。拉曼光谱(Raman)与红外光谱互为补充，可以鉴别特殊的结构特 征或特征基团。它能将激光聚焦在面积lI_tm2的极小区域内，进行分子结构和成 分的微区分析，也可实现微秒、纳秒和皮秒量级的分析。拉曼位移的大小、强度 及拉曼峰形状是鉴定化学键、官能团的重要依据。精子为生命体中重要的生物分 子，其结构与功能已被广泛研究。成熟的精子的细胞染色质高度浓缩，大部分基 因组处于甲基化修饰的状态。而严重畸形的精子，除了形态学上与正常精子的差 异，其精子细胞染色质的表观遗传修饰也发生变异。既往精子形态学分析，精子 DNA的评估方法所使用的精液样品仅限于临床的检测报告。而我们采用的拉曼 光谱非侵入性技术，对精子受精能力与形态提供了详细的的评估，以此探寻可能 发生在精子细胞染色质的分子结构变异，进一步筛选正常精子用于辅助生殖技 术。 材料与方法选取在上海交通大学医学院附属仁济医院就诊的严重畸形的 断头精子患者为研究对象，以生育者的正常形态精子为对照。患者被告知实验目 的并签署知情同意书。首先，利用CASA进行精液常规检查；采用Diff-Quick 形态染色方法，观察精子正常形态率和显微结构。精子洗涤纯化采用45％和90％ 20分钟)；2．移去上层梯度液，加入 lml，加入lml新鲜精液，梯度离心(3009 DPBS液2ml，充分混匀，4009离心5分钟，弃去上清，重复洗两次；3．下层沉 淀的精子用100ulDPBS液溶解，吸取纯化后的精液样本2ul，制备成精液涂片， R200-L)进行分析。拉曼显微镜扫描参数如下： 运用激光拉曼分析仪器(Senterra -120- 入射光调节为反射光，激光激发波为532nm，激光功率5row，定位精子头部细 胞染色质区重复扫描三次。获得的拉曼数据谱峰，应用RRUFF拉曼数据库 (http：／／rruff．geo．arizona．edu／maff／)检索，分析波形变化和位移。 结果精液常规显示严重断头精子患者的精液密度为62×106／ml，前向运动 和)70％。通过拉曼光谱比对，共有两处主要峰差异区。其中一区为甲基化特 异峰区，断头精子甲基化峰区明显高于正常组，峰位移和峰形无变化。二区为未 知峰区，峰的强度和峰形明显发生变化，但具体对应的化学分子在现有的数据库 和文献均未有报道。 讨论与结论 本例患者的严重畸形断头精子的染色质区具有明显的甲基 峰增强。甲基化是成熟精子染色质的一种重要的表观遗传修饰，其作用是维持精 子遗传物质的稳定性，关闭核基因的表达。研究报道，不育的精子可能与精子的 过度甲基化异常相关。这些甲基化的异常有两种成因：一是原始生殖细胞(PGC) 时期发生的异常甲基化，另外一种是生殖干细胞(SSC)时期产生的甲基化，最 终影响正常精子的发生和成熟。此外，正常受精后精子的甲基化修饰的基因组会 重新发生去甲基化和建立新的甲基化修饰，启动受精卵裂和胚胎的发育。我们的 研究提示，严重畸形的断头精子染色质区在PGC或SSC时期发生甲基化异常， 导致断头精子的发生，可能会继续影响受精和胚胎发育。根据生殖中心的ICSI 的治疗结局反馈，该断头精子可以完成受精，但胚胎发育只能进行到四到五细胞 阶段，后期发育停滞。 综上所述，由于拉曼光谱分析，无需破坏样品，能直接对精子形态与功能进 行无损鉴别，这对精子的DNA分子结构，以及和DNA与其他分子间的作用研 究特别重要。拉曼光谱作为一种无损伤的生殖细胞评估技术，对临床有重大的研 究价值，可望成为精子形态与功能的新的无创评估技术。 【关键词】 甲基化；断头精子；拉曼光谱； ·12l·