五指山猪近交系精原干细胞体外分离、培养实验的研究.pdfVIP

畜牧部分 173 五指山猪近交系精原干细胞体外分离、培养实验研究。 成钢，冯书堂“，牟玉莲 中国农业科学院畜牧研究所，北京，100094 摘要：本实验对各个不同发育阶段五指山小型猪(WZSP)近交系的睾丸组织，采用不同的消化和培养方法进行了 一系列的探索、研究。实验显示：培养SSCs的最佳时限为仔猪出生后l～20日龄；对不同日龄仔猪采用不同消化方 法，以DMEM为基础培养液并添加不同成分，34℃，5％CO：培养箱中饱和湿度条件下培养，可获得较好的分离培养结 和单细胞消失；采用曲细精管组织贴壁培养法也同样获得桑葚状SSCs集落，细胞集落在培养5d后出现，悬浮或半悬浮 生长。此外，睾丸组织在4℃PBS液中存放24h后，仍可作为SSCs分离、培养的材料。结果表明：本研究初步掌握了 WZSP近交系精原干细胞体外分离、培养的技术方法，为其进一步深入研究提供了技术依据和操作方法。 关键词：WZSP；SSCs；消化方法；日龄；体外培养 stem cell，SSCs)是指未分化的A型精原细胞，位：F雄性哺乳动物体内 精原干细胞(spermatogonial 的曲细精管生精上皮基膜内，在复杂且高度有序的精子发生过程中占据极其重要的地位。精原于细胞 独有的生物学特性，使其在医学、畜牧业生产等领域有其广阔的应用前景，转基因技术与精原于细胞异 体及异种移植技术相结合将会为克隆动物、转基因动物生产及一些人类遗传性疾病的基因治疗提供新 的机遇与途径。从所得资料国外已对小鼠、大鼠、猪、人等多种哺乳动物的精原干细胞进行过分离纯 化。Bellve等【1 等(1999)[2 人的精原细胞并进行低温冷冻保存实验。在国内，精原干细胞的分离、纯化主要集中在小鼠，经纯化后 其纯度可达68．76％(2000张学明)【4J。体外分离、培养SSCs是件费时、费力的工作，在目前，国内还没 有见到关于猪SSCs体外分离、培养的系统报道。本实验的研究意义在于通过对不同目龄猪睾丸细胞 培养实验，确定一个仔猪体外分离、培养SSCs的相对日龄时限，最大程度、最为有效的分离SSCs进行 体外培养，总结出一一套简单可行的消化培养方法及步骤，用于体外分离、培养SSCs。，本研究以五指JJl 小型猪近交系为材料，进行实验研究更显示出其独特的研究意义和应用前景。 1材料与方法 1。1 实验动物 中国农业科学院畜牧研究所提供的五指山小型猪近交系 2月龄、2月龄以上各个不同发育阶段WZSP的睾丸组织。， *本研究由科技部“863”NO2003AA205100课题经费资助 **通讯作者：冯书堂研究员、博士生譬师。佟者筒分：戚鲷《舅)1976年出生，硕士橱究生，研究方穗：澍物繁殖生物技术 174 2005学术年会 1．2实验方法 1．2．1 霉素+1％丙酮酸钠，使用前应将培养液在34℃，5％C02培养箱中孵育2h以上。 1．2．2曲细精管组织贴壁培养法(目的是为了更好的在显微镜下观察曲细精管内部的发育情况、细 胞类型，最终确定消化方法，同时也作为培养SSCs方法的另一种尝试)： 无菌取出睾丸，去除睾丸脂肪垫、附睾及白膜，取出0．3。0．5 g睾丸组织，用眼科剪将组织剪成大 小一致的小块，采用静置法，双抗PBS液多次洗涤，去除红细胞及杂细胞，用吸管吸取适量已经沉降到 管底的曲细精管小段，放置于事先涂有明胶的35mm培养皿，曲细精管应均匀涂散于皿中，最后用吸管 吸除多余液体，放置于34℃，5％C02培养箱中饱和湿度条件下培养，24h后显微镜下观察见曲细精管 已贴壁时，小心加入培养液，继续培养观察。 1．2．3不同日龄WZSP睾丸细胞悬液的制备 1．2．3．11 t3龄、2日龄、313龄、4日龄、6日龄、8日龄仔猪睾丸细胞悬液的制备： l一8日龄仔猪睾丸由于体积小、重量轻，先用双抗PBS冲洗数次后，小心拨去睾丸被膜，在玻璃表 面皿中用眼科剪剪碎，放入离心管，采用沉降或低速离心的方法去除血细胞，经多次洗涤后，用0．25％ 止消化，沉降5～10min后，收集上清，4层铜网过滤后多次离心洗涤，最后将沉降的细胞用适量培养液 吹起，制得细胞悬液。 1．2．