总DNA的提取.docVIP

第二章 材料与方法 2.2总DNA的提取 土壤中存在着大量的腐植酸、蛋白质等杂质都将会影响以下实验步骤，而过多的纯化的步骤又会造成DNA的大量损失和DNA片段的破碎。土壤总DNA的质量直接决定实验着是否能够准确的反应微生物的实际群落组成结构，实验证明不同提取方法获得的DNA，经DGGE分析会产生不同的群落结构指纹图谱[69]，因此选用合适的DNA 提取方法是十分重要的；，所以必须在在DNA的质量和纯度上做出最佳的平衡选择，Krsek和Welington [70]认为玻珠+溶菌酶+SDS的组合可从土壤中获较高产量和纯度的DNA。直接提取法参照Krsek和Welington [72]的试验方法并略作改变，具体使用试剂和步骤方法如下： 实验试剂： DNA提取液（1%(W/V) CTAB(十六烷基三乙基溴化铵) 1.5mol/lNaCl、100mM磷酸钠、100mM Tris-HCl、100mM EDTA、PH=8）；20mg/ml蛋白酶K；50mg/ml溶菌酶；10%SDS；饱和酚；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1 V/+V)；氯仿；100%乙醇；70%乙醇；异丙醇.0 mL EP管然后加入1 m提取缓冲液混匀，65℃水浴中反复冻融2次； 2.加入溶菌酶(终浓度5mg/ml) 和蛋白酶K终浓度0.2 mg/m加入终浓度为％的SDS混合均匀，在65 ℃水浴中放置60 min，期间每min颠倒混匀一次12,000 rpm离心20 min，上清液转移到另一个干净的EP管上下颠倒EP管,000rpm 离心10 分钟，将上清液转入另一洁净的EP管中； 4.在上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒EP管混匀，1,000 rpm离心10min，加入0.6倍体积的异丙醇上下颠倒EP管混匀，-20℃放置1小时，12,000 rpm室温离心15min；弃上清，75%乙醇洗涤沉淀两次，在室温下自然干燥，用μl灭菌双蒸水TE缓冲液重悬DNA 沉淀，充分溶解后放入－80 ℃冰箱保存。80 ℃冰箱保存。×TAE 电泳缓冲液（TAE：0.04 M Tris-醋酸，0.001 M EDTA）EB (Ethidium bromide，溴化乙锭)溶液或GeneFinderTM染料(Bio-V公司)等核酸染料。 实验步骤： 1. 称取0.8g-1.5g琼脂糖（视实验所需分离DNA片段大小而定）加入到三角瓶中，加入100ml 1×TAE 溶液，于微波炉中加热，稍待冷却后，倒入已插上样品梳的凝胶槽中； 2. 水平放置等待琼脂糖凝固，小心拔出梳子，将凝胶连同凝胶槽一同放入已校准水平的电泳槽中，电泳槽中加入1×TAE电泳液缓冲液，高于凝胶表面约0.5cm为适； 3. 将含有指示剂的DNA样品和DNA Maker分别加入点样孔后接通电源，设定电压和电泳时间（视实验所需分离DNA片段大小和凝胶大小而定）； 表2-凝胶浓度与DNA片段大小的关系 Table 2- The gel concentration used for various length of DNA fragment 琼脂糖凝胶浓度（%） 线性DNA分子的有效分离范围（kb） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 指示剂离胶前沿1/3处透析袋的处理取长10～20 cm的透析袋将透析袋在1mM EDTApH8.0）、2%/v）NaHCO3溶液中煮沸10分钟取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗在1mM EDTA溶液中pH8.0）煮沸10分钟让透析袋自然冷却，4℃贮存贮存期间，始终让透析袋浸入溶液使用前，用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁要手套 DNA电泳分离后染色，确定目标片段的位置用手术刀片切下含有目的DNA片段的将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1×TAE，然后将所切胶条放入透析袋中倒掉多余的缓冲液只留100μ左右，夹紧另一端袋内不能留有气泡将含有胶的透折袋放在1×TAE电泳槽中，45 V/cm，23小时，DNA被电泳脱到袋子壁上更换电极，反向电泳，使DNA从袋壁返回袋腔打开透析袋，小心地倒出胶周围的电泳缓冲液于一灭菌EP管中，然后用少量1×TE冲洗袋壁，并将冲洗液一并吸入EP管中将透析袋及胶条置于紫外灯下，观察收集是否完全溶液用苯酚/氯仿和氯仿各抽提一次，加入0.1体积3M醋酸钠，用2倍体积无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗23次，干燥后溶于适量的灭菌双蒸水TE缓冲液，所得DNA用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量及片段大小并放入－80 ℃冰箱保存。切下含的DNA片段的胶条、称出其质量（m），放入灭菌1.5 mL离心管中，按m∶V(mg∶mL）=1∶1的比例加入相应体积的Binding Buffer；将混合物置于55～65℃水浴，直至凝胶完全溶解