VFA测定步骤与方法.docVIP

挥发性脂肪酸的测定 一、GC（Gas chromatograph）工作条件 仪器： GC-14B型气相色谱仪（日本岛津公司） 毛细柱：NUKOLTM Capillary Column ( Supelco )；Column No.34292-07B 30m×0.32mm×0.25μm film thickness 气相色谱仪参数：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温130℃，汽化温度180℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度180℃，载气为氮气，压力为60 KPa，氢气压力为50 KPa，氧气压力50 KPa，灵敏度（档）为101，衰减3.0 二、样品制备 1．试剂制备 （1）配制25%w/v 的偏磷酸溶液，将25克偏磷酸溶在100mL双蒸水中 （2）巴豆酸的配制，在100ml的偏磷酸溶液中加入0.6464g的巴豆酸 （3）标准样品，准确称取色谱标准级乙酸0.9100 g、丙酸0.3700 g、丁酸0.1765 g、异丁酸0.1765g、戊酸和异戊酸分别为0.1985g，分别溶于双蒸水中，再各自定容至100 mL。 2．样品制备 (1) 发酵液取（或过滤瘤胃液）VFA测定 1ml样品到离心管中，再加入0.2 ml的偏磷酸巴豆酸混合溶液，－20℃冰箱保存过夜，解冻后12000rpm离心min，取上清液保存，测定前12000rpm离心min(或少许通过0.22μm针式滤器，滤液直接进样用1.0微升微量进样器瞬时注入色谱仪，进样量为0.2－1.0μL。 (2) 食糜及粪样VFA测定 取1克置于离心管中，加入5－10倍的水，混合均匀。取1mL上清夜，加偏磷酸巴豆酸0.2mL/mL。其它步骤同上。 3．保留时间的确定 与样品处理相同，在1 ml标准样品中加入0.2mL偏磷酸与巴豆酸的混合样，上样测出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的保留时间。 4．有机酸浓度的计算 通过标准样品和内标巴豆酸各自的（或浓度）和峰面积可以计算出乙酸、丙酸及丁酸等有机酸的相对校正因子，然后根据乙酸、丙酸及丁酸的重量（或浓度）与其峰面积成正比计算出各个样品中的乙酸、丙酸及丁酸浓度。 （样品某酸峰面积值×巴豆酸标样峰面积×某酸标样浓度） 某酸浓度(mM)＝ （样品中巴豆酸面积值×标样某酸峰面积） 5．有机酸 将某有机酸（如乙酸），测定其峰面积值，计算其率。 乙酸：1.2872±0.06404 丙酸： .5104±0.01961 丁酸： .3422 ±0.01037 异丁酸：.4668±0.01447 戊酸： .1431±0.01754 异戊酸：.1671±0.03496 6. 不同标样有机酸的GC峰 混合标样 样品 标样的分子量和出峰时间 沸点 分子量 出峰时间 巴豆酸 86.09 1.95min 乙酸 118℃ 60.05 0.87min 丙酸 141℃ 74.08 1.0min 丁酸 163.5℃ 88.11 1.2min 异丁酸 154.5℃ 88.11 1.06min 戊酸 102.14 1.68min 异戊酸 102.14 1.38min 气相色谱的气体工作条件（VFA测定） 钢瓶减压阀压力 气象色谱压力表 氢气 0.14MPa KPa 空气(AIR1) 0.4MPa KPa 氮气（ARRIER2） 0.4MPa 0KPa PRIMARY CARRIER(P) 300KPa 乙酸 巴豆酸 丙酸 异丁酸 戊酸 丁酸 异戊酸 乙酸 丙酸 异丁酸 丁酸 异戊酸 戊酸 巴豆酸