引物合成步骤.docVIP

引物化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5→3方向延伸，而是由3端开始。具体的反应步骤如下： 一、脱保护基(Deblocking)?用三氯乙酸(Trichloroacetic?Acid，TCA)脱去连结在CPG(Controlled?Pore?Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5-羟基端，以供下一步缩合反应。 二、活化(Activation)?将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3-端已被活化，但5-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 三、连接(Coupling)?亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 四、封闭(Capping)?缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 五、氧化(Oxidation)?缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。?经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷