一例奶牛发生牛支原体肺炎的诊断.pdfVIP

1,3 1,3 1,2 1,2 1,2 ∗ 1,2,3 （1 华中农业大学动物医学院; 2 华中农业大学农业微生物学国家重点实验室; 3 国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室 武汉 430070 ） 摘 要：牛支原体是严重影响养牛业发展的重要病原。2008年我们报道牛支原体导致“肉牛传染性牛 支原体肺炎”以来，主要在肉牛发现该病。本文从临床出现类似症状的运输后发病奶牛采集样本，经细菌 培养和支原体培养、特异性PCR扩增和16s rRNA测序等病原学检测证实为牛支原体感染。 关键词：牛支原体；奶牛；感染；呼吸系统疾病 牛支原体(Mycoplasma bovis) 是感染牛的一种重要病原，除导致牛肺炎、乳腺炎外，还 可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病[1] 。在过去的两年 中，我们确诊了数十起肉牛的牛支原体肺炎 [2,3] ，发病牛都在不久前经历过长途运输。近期 湖北某奶牛场新购入 91 头奶牛，部分出现发烧、流涕、咳嗽、伴腹泻、关节肿胀等症状， 就诊时已死亡 15 头。经实验室确诊为牛支原体肺炎，现就该奶牛场临床发病与病原学鉴定 情况报告如下。 1 材料与方法 1.1 样品 湖北某地奶牛场无菌采集并送检的奶牛肺脏、喉及气管样品 3 份。 1.2 培养基 胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptose Soya Agar, TSA ）及胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptic Soy Broth, TSB ）培养基购自BD 公司。按照试剂说明配置 TSA 固体培养基及 TSB 液体培养基。类胸 膜肺炎(Pleuropneumonia-like organisms , PPLO) 肉汤粉、酵母粉、琼脂粉等购自BD 公司， MEM 培养基购自 Sigma 公司，马血清购自 Hyclone 公司，精氨酸购自上海伯奥生物科技有 限公司。按照文献[4]配制支原体液体与固体培养基的，但培养基中未加 1%醋酸铊溶液。 1.3 细菌的分离培养 按文献[5]取小块组织样本切面涂抹 TSA 平板，划线接种，37℃ 恒温箱内培养。菌落线 培养后，用革兰氏染色和油镜观察进行形态学初步鉴定。 1.4 细菌的 16 SrRNA 鉴定 无菌牙签挑取单个菌落，加入装有适量灭菌水的无菌离心管中，煮沸 10 min，冰浴 1min， 12000r/min 离心 30s，取上清作为 DNA 模板，按照本实验室建立的方法，用 16 SrRNA 通 用引物进行 PCR 扩增[3]，所得PCR 产物经回收后克隆至 pMD-18T 载体中，送上海生物工 程技术服务有限公司测序。测序结果与 GenBank 中的相应序列进行同源性比对，确定菌株 鉴定结果。 1.5 牛支原体分离培养 分别将小块肺组织样本、气管拭子、喉拭子涂于 PPLO 固体培养基表面，于含 5% CO2 的细胞培养箱中培养；同时将小块组织样本投入到PPLO 液体培养基中。2～3 d 后，用光学 ∗现代农业（肉牛）产业技术体系 (nycytx-38）建设专项资金资助。 作者简介：胡长敏 (1977- ), 男, 湖北宜昌人, 讲师, 博士, 研究方向为奶牛疾病。 ∗通讯作者：电话027 email: aizhen@mail.hzau.edu.cn 显微镜低倍观察菌落形态。支原体在固体培养基上菌落应具有“煎蛋样”典型特征，液体培 养基由红色变为黄色，并且透亮。 1.6 牛支原体的 PCR 鉴定 用本实验室鉴定的牛支原体 PCR 方法进行鉴定，同时将 PCR 产物克隆至 pMD-18T 载 [3] 体中，进行测序分析 。 1.7 药敏试验 利用药敏纸片法（购于杭州天河微生物试剂有限公司）检测敏感药物。取纯化菌落接种 于 TSB 液体培养基中，37℃震荡培养过夜，制备固体营养琼脂平皿，在琼脂表面均匀涂布 菌液，将环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、头孢拉定、庆大霉素、丁胺卡那霉素、四环素、 红霉素、磺胺、杆菌肽药敏纸片贴在培养基表面，置于 37℃恒温培养箱中培养 24h 后观察 结果。游标卡尺量取抑