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* 免疫标记技术 Immunolabeling technique 免疫标记技术 = 抗原抗体反应 示踪物标记 灵敏性 特异性 免疫标记技术的主要特点： 高特异性、高灵敏性 免疫技术+ 标记技术 酶 荧光素 同位素 免疫标记技术 放射物标记技术 酶标技术 免疫荧光技术 其他标记技术 酶联免疫吸附技术 酶免疫组化技术 双抗体夹心法 竞 争 法 双抗原夹心法 间 接 法 双位一点法 1. ELISA检测HBsAg (小组做) 实验内容 3. 免疫标记技术 (录像) 2. 尿液HCG检测(胶体金法)(小组做) 实验目的 1.掌握酶联免疫吸附实验的基本原理； 2.了解利用双抗体夹心法测定HBsAg的方法。 3. 了解胶体金法检测HCG的原理、方法。 基本原理 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。 Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应 一、酶免疫技术 EIA 固相 聚苯乙烯 Ag或Ab吸附到固相上的过程,称为包被 (酶免疫测定法) 基本特点： ①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性； ②酶促反应专一性，保证特异性； ③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定； ⑤操作简便，安全易行。 常用酶及其底物 常用底物： 邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性, 但水溶性差。 常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、价高，故应用不如HRP普及。 1.辣根过氧化物酶(HRP) 2.碱性磷酸酶(AP) 酶联免疫吸附实验 enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA ） ELISA基本的实验过程 双抗体夹心法检测HBsAg HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb HBeAg, HBeAb HBcAb(IgG,IgM) 乙肝表面抗原,存在于HBV感染的急性期及慢性期的血清中,为感染指标。 实验材料 1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。 实验步骤 2. 在各孔内加入酶标抗体1滴, 37℃温育30分钟。 3. 各孔分别加入洗涤液(加满)---甩掉，反复3次，然后在吸水纸上吸干(倒扣在吸水纸上)。 4. 各孔内加入底物液A、B各1滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应15分钟。 5. 各孔内加入终止液1滴，观察结果。 1. 将已包被的孔编号，分别加入阳性对照血清、阴性对照血清及待测血清各1滴。 结果判定 2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性； 3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。 1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性； 注意事项 2.洗涤必须彻底，防止产生假阳性。 1.加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成。 二、胶体金法检测尿液HCG 人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin, HCG) 受精卵子移行到子宫内着床后，形成胚胎，在胚胎的发育过程中，胎盘合体滋养层细胞产生大量的HCG，是一种具有促性腺发育的糖蛋白类激素,可通过孕妇血液循环而排泄到尿中。 临床上常用抗HCG检测尿液中的HCG以辅助早孕诊断和其他临床相关疾病。 胶体金标记免疫技术 (金标法) 胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)； 胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。 胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。