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实验十 植物体内氧自由基的测定和清除 【实验原理】 通过呼吸作用进入生物体内的氧分子，参与酶促或非酶促反应时，只接受一个电子后转变为超氧阴离子自由基( )， 既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍 H2O2，羟自由基(·OH)，单线态氧(1O2)等。·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质(RH)过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基(·R)、脂氧自由基(RO·)、脂过氧自由基(ROO·和脂过氧化物(ROOH)。 基团旁边的小圆点为不成对价的电子，这种基团即称为自由基，带有个-O-O-的是过氧化物，1O2的电子处于激发状态。这些含有氧而又比O2活泼很多的化合物，称为活性氧，也有人将它们统归为氧自由基类。 一切需氧生物均能产生活性氧，在其体内有一套完整的活性氧清除系统(抗氧化酶和抗氧化剂)，能将活性氧转变为活性较低的物质，机体因此受到保护。 利用经胺氧化的方法可以检测生物系统中自由基含量。原理是： 与羟胺反应生成NO2- ， NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，染料在λ540nm有显著吸收，根据OD540可以算出样品中的 含量。 【实验材料和设备】 大豆、绿豆、花生3d龄黄化幼苗 低温离心机、恒温水浴锅、分光光度计。 【实验步骤】 亚硝酸根标准曲线的制作 2mL系列浓度的NaN02(0、5、10、15、20、30、40和50μmol/L)分别加入1mL对氨基苯磺酸和1mLα-荼胺，于25℃中保温30min，然后测定OD540，以[N02-]和测得的OD540值互为函数作图，制得亚硝酸根标准曲线。 植物提取液的制备 大豆、绿豆和花生3d龄黄化幼苗的下胚轴0.5-2.5g，加入5mL 50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.8)研磨后以纱布过滤，并以10500×g离心20min，上清夜即为粗酶液。 含量的测定 0.5mL样品提取液中加入0.5mL 50mmo1/L磷酸缓冲液(pH7.8)，1mL 1mmo1／I盐酸羟胺，摇匀，于25℃中保温l h。然后再加人l mL对氨基苯磺酸混匀，加入1mLα-荼胺，混合，于25℃中保温30min。取出后用分光光度计测定波长530nm的OD值。 根据测得的OD540，查N02-标准曲线，将OD540换算成[N02-]，然后依照羟胺与 的反应式： NH2OH十2 十H+ NO2-十H2O2十H2O 从[NO2-]对[ ]进行化学计量，即将 [NO2-]乘以2，得到[ ]的量。 根据记录样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，可求得产生速率(nmol/min/mg蛋白)。 【注意事项】 如果样品中含有大量的叶绿素将干扰测定，可在样品与羟胺温浴后，加入等体积的乙醚萃取叶绿素，然后再加入对氨基苯磺胺和α-萘胺作的NO2-显色反应。 * * 植物生物学实验-植物生理部分 . O2 - . O2 - . O2 - . O2 - . O2 - . O2 - . O2 - . O2 - . O2 -