基因克隆载体.docVIP

I 逆境胁迫因子主要有干旱、盐渍、低温、水涝等，是限制植物生长和区域分 布以及影响农作物产量和质量的重要因素。植物对这些逆境胁迫的适应主要被转 录因子和调节基因（诸如控制多重抵御的酶、蛋白等）所介导。现有研究证明， 与转录因子活力有关联的是转录辅激活子，它能增强转录因子和顺式作用元件的 结合。MBF1是一个转录辅激活子，通过一个激活物和一个TATA盒结合蛋白的桥 连作用来调节转录激活。MBF1基因最早是在蚕、果蝇等动物体中被发现，后来在 植物中也发现了MBF1基因。据报道，在拟南芥中的MBF1基因的超表达能增强 其抵抗逆境胁迫的能力，而在番茄中关于此基因还没有相关的报道，本论文拟通 过在番茄中超表达MBF1基因研究其对逆境胁迫的抗性能力，从而明确MBF1基 因的分子作用机制，主要研究内容及结果如下： 1.番茄MBF1基因的克隆 以AC++番茄果实的总RNA为模板，体外反转录合成cDNA，以cDNA为模 板，通过PCR扩增得到得632bp大小的片段，将其命名为LeMBF1，并登录NCBI GenBank，登录号为EF051474。将其与拟南芥中的MBF1基因进行同源性比较， 在DNA水平上的序列相似性为56%，在氨基酸水平上的序列相似性为82%，是一 个新基因。 2.Northern杂交技术分析番茄LeMBF1基因的表达特性 克隆番茄MBF1（LeMBF1）基因特异片段，以此作为探针,通过Northern杂 交技术分析LeMBF1基因的表达特性，结果显示LeMBF1基因的表达能被高温、 干旱诱导，被复水所抑制；伤害处理能诱导WT番茄叶片中该基因的表达，对Nr 番茄叶片中该基因的表达基本无影响，抑制rin番茄叶片中该基因的表达；外源乙 烯处理绿熟期果实，LeMBF1基因的表达变化不明显，说明在这一时期外源乙烯并 不诱导LeMBF1基因的表达。 3.双元超表达载体pBIN19-MBF1的构建 验证的LeMBF1基因与经Pst I酶切的pDH51载体通过T4 DNA连接酶连接， 连接产物转经PCR以及酶切鉴定确为重组中间载体质粒，且外源片段方向正确， 命名为pDH51-MBF1。中间载体pDH51-MBF1经EcoR I酶切获得了包含35S启动 子、MBF1基因、35S终止子的片段，此片段与经EcoR I酶切的pBIN19载体连接， 连接产物经PCR及酶切鉴定确为重组植物双元表达载体质粒，命名为 pBIN19-MBF1。 4.再生番茄植株的获得以AC ＋＋ 番茄子叶为外植体，通过农杆菌LBA4404介导，将CaMV 35S启动 子调控下的MBF1基因转入番茄，经过50 mg/L Kan及500 mg/L的Sm筛选，获 得一部分生根的再生植株。VIII ABA Abscisic acid脱落酸 Amp Ampicillin氨苄青霉素 ATP Adenosine triphosphate三磷酸腺苷 BTM Basal transcrip tionalmachinery基础转录机器 bZIP a family of transcription factor with basic region and Leu-zipper motif 带有碱性区域和亮氨酸 拉链的转录因子家族 CARM1 Coactivator associated argi nine methyltransferase 1精氨酸甲基转移酶1 CaMV 35S Cauliflower mosaic virus 35S promoter花椰菜花叶病毒 35S启动子 cDNA Complementary DNA互补DNA DNA Deoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸 dNTP deoxynucleotide triphosphates dATP/dTTP/dCTP/dGTP 的混合物 DREB Dehydration Responsive Element Binding干旱应答效应元件 EB Ethidium bromide溴化乙锭 E.coli Escherichia coli大肠杆菌 EDTA Ethylene diamine tetracetic acid乙二氨四乙酸 REBP/AP2 Ethylene-responsive element乙烯反应因子 GCN Giant cerebral neuron巨大脑神经元 HAT Histone acetyltransferase组蛋白乙酰基转移酶 HRE Hormone response element激素效应元件 IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside异丙基-β-D-硫代 半乳糖苷 Kan Kanamycin卡那霉素 LB Luria-bertani media LB培养基 MB