冬小麦麸皮抗冻蛋白一级结构第研究.pdfVIP

第37卷 分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告 第5期 2009年5月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 659—664 冬小麦麸皮抗冻蛋白一级结构的研究 张超1’2 马越1 赵晓燕1 张晖n 姚惠源2 (北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097)2(江南大学，食品科学与工程国家重点实验室，无锡214122) 捕要冬小麦麸皮抗冻蛋白(TaAFP)的一级结构是研究其高级结构和功能的基础。本研究结合Ⅳ·末端测 序技术和肽指纹图谱技术，测定TaAFP的一级结构，并对其同源性进行分析。MALDI．TOF．MS质谱分析显示 TaAFP的分子量为13637．711 白酶)分别对TaAFP酶解．并对各个酶解片段的肽指纹图谱进行解析和连接，最终确定TaAFP的一级结构为 与植物细胞壁和抵抗寒冷相关的蛋白质。 关键词冬小麦，麸皮，抗冻蛋白，分子量，一级结构 1 引 言 抗冻蛋白是一种具有非依数性降低冰点能力的蛋白质…，由于其功能独特，已经引起了广大研究 者的关注，尤其是对其抗冻机理的关注。本课题组新近在冬小麦麸皮中发现的冬小麦麸皮抗冻蛋白 TaAFP的结构。蛋白质的结构主要包括一级、二级、三级及四级结构，其中一级结构是形成高级结构和 具有功能性的基础口’41。因此，本研究首先对TaAFP的一级结构进行解析。 蛋白质一级结构的测定方法主要有J、『一末端测序和肽指纹图谱解析两种方法，其中，Ⅳ一末端测序主 要是测定序列J『＼r一末端氨基酸残基，一般可以测定15—20个氨基酸残基，随着残基数量增加，测定准确 性降低，主要用于小肽序列测定¨o；而肽指纹图谱是获得蛋白质片段信息的有效方法，它通过不同酶对 蛋白质进行酶解，根据各个片段的分子量以及二级质谱下蛋白质片段的信息推断测定蛋白质序列，主要 用于较长的蛋白质序列。可以发现Ⅳ一末端测序和肽指纹图谱是相互补充的检测方法。因此，本研究采 用Ⅳ．末端测序和肽指纹图谱结合的方法测定TaAFP的一级结构，既可以直接获得Ⅳ一末端信息，又可以 进一步对全序列进行指认，并且两种方法可以相互印证。同时，本研究还进一步对TaAFP序列结构与 相关蛋白进行比对分析，确定其进化树。 2 实验部分 2．1 TaAFP的制备 TaAFP按照文献[2]的方法纯化。 2．2电泳 BandscanVersion 5．0进行统计。 PAGE操作与SDS．PAGE类似，不同点在于样品未经沸水浴煮沸、样品缓冲液中未添加口一巯基乙醇 和SDS以及凝胶和电级缓冲液中均不添加SDS。 2．3 MALDI-TOF-MS测定样品的分子量 样品分子量采用飞行时间质谱仪测定(AutoFlex 2008-08-16收稿；2008．11-22接受 本文系国家十五攻关项目(No．2001BASOIA03)资助 ·E—mall：zh¨gIlui@sytu．edu．cn 万方数据 分析化学 第37卷 白质浓度调节为1．0g／L，将样品与基质CCA(OC-氰基．4一羟基肉桂酸，浓度15g／L)按照2：l的体积比混 合，37℃温育6h。2弘L混合液放置在金盘上测定。测定采用N：激光源，波长337nm，正离子的线性 飞行方式，飞行管长度1．22m，加速电压20kV。 2．4样品的Ⅳ-末端测定 mmol／L mmol／L 样品用SDS．PAGE分离，在含有20Tris／HCl和190 液中转到PVDF上¨’9】，然后将相应的蛋白条带进行Edman降解，测定Ⅳ．末端。测定采用蛋白Ⅳ一末端 序列测定仪(AppliedBiosystems，Foster，CA)，进行15个循环。 2．5样品酶切的方法 mmol／LTris／ 样品进行酶解，酶解的片段用MS／MS分析。将样品与Trypsin按照200：l(w／w)溶解于50 HCI缓冲液(含有2 mob／L尿素，pH8．0)，在37℃下温育18