TaKaRa定量PCR介绍.ppt

定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 检测方法 Cycling Probe法 SNP 位点 ALDH2 type1和ALDH2 type2 (G/A) 使用试剂 Cycleave PCR? Core Kit (DCY501) 使用仪器 Thermal Cycler Dice? Real Time System (TP800) 实验背景 Aldehyde dehydrogenase-2（ALDH2）基因位于人类第12对 染色体q24位置，有ALDH2 type1和ALDH2 type2两种基因型， 其两种基因型序列的差别在exon12第487个氨基酸位置， ALDH2 type1型为Glu(GAA), ALDH2 type2型为Lys(AAA)。 实时荧光定量PCR介绍 * * SNP解析原理示意图 实时荧光定量PCR介绍 * * Cycling Probe法 PCR-RFLP法 ROX FAM ROX、FAM通道均有信号检出 Eco57 I CTGAAG(N)16 GACTTC(N)14 wild type :切断 Mutant type :不切断 ROX FAM Mutant wild ROX通道有信号检出 FAM 通道检出荧光信号 ROX FAM 杂合型 (hetero) 野生型 (wild homo) 突变型 (mutant homo) Mutant wild Mutant wild 定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 实时荧光定量PCR介绍 * * 定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 提取样品 引物、探针设计 Real Time PCR反应 数据分析 流 程 实时荧光定量PCR介绍 * * 从人血液中（共计10个样品）提取基因组DNA。 样品提取 提取试剂：Blood Genome DNA Extraction Kit (D9081) 定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 定量反应 反应试剂：Cycleave PCR? Core Kit (DCY501) 实时荧光定量PCR介绍 * * 实验结果 Allele 1 : 突变型 Allele 2 : 野生型 定性分析应用例 对人的ALDH2基因进行SNP解析 Hetero : 杂合型 实时荧光定量PCR介绍 * * 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 检测方法 TaqMan? probe 法 检测样品 3个从SARS病毒培养液中提取的Genomic RNA 目的基因 SARS病毒RNA 内 参 SARS Internal Control RNA 标 准 品 SARS Control RNA 试 剂 One Step PrimeScript? RT-PCR Kit （Perfect Real Time）（DRR064） 仪 器 Smart Cycler Ⅱ 实时荧光定量PCR介绍 * * SYN247 F02 SYN247R03 SYN247 F01 SYN247R02 SYN247R01 SYN247 F01 BamH Ⅰ Hind Ⅲ pBluescript II SK(+) Vector T7 Promoter BamH Ⅰ Hind Ⅲ Sac Ⅰ site SARS Control RNA构建 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 * * 纯化的SARS Control RNA OD值测定结果 体外转录的SARS Control RNA 电泳照片 M1 M2 M1: ?-Hind Ⅲ digest M2: DL2,000 Marker DNase I 处理前 DNase I 处理后 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 * * ?DNA BNITMSARAs2 Adaptor R SacⅠsite Bam HⅠsite BNITMSARS1 Adaptor F T7 Promoter SARS Internal Control RNA的构建 A A pBluescriptII SK(+) Vector 绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 * *