质粒改造-修改.pptVIP

质粒改造 赵雨佳 张楠楠 实验流程: 第一步：了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。选用哪种载体要以实验目的为准绳。 第二步：再看筛选标记，如抗性. ①Ampr：水解p一内酰胺环，具氨苄抗性。 ②tetr：阻止四环素进入细胞。 ③camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 ④neor(kanr)：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。 ⑤hygr ：使潮霉素B失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 合格质粒的组成要素 1、复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 2、抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ 3、多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 4、P/E 启动子/增强子 5、Terms 终止信号 6、加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用 载体选择 1、构建DNA重组体的目的，选择合适的克隆载体/表达载体。 2、载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭。 （3）对原核表达载体应该注意 3 点： ①选择合适的启动子及相应的受体菌； ②用于表达真核蛋白质注意阅读框错位； ③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。 克隆载体的必要性 基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？ 表达载体是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？ 构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？ pcr产物直接酶切连接？ 数量 1.克隆的目可用于各种文库的建立，比如人类基因组计划。 2.克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。 3.克隆载体可以使目的基因在宿主中低成本便捷的扩增 4.表达载体的目的多样化的用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。 质量 1.克隆载体便于稳定保存目的基因 2.克隆载体上有很多合适的酶切位点供选用 3.克隆载体提供验证，如测序的方法 一般的策略：将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。 T/A 克隆载体可以直接克隆 PCR 产物，省去了两端加装识别位点的设计，可直接连接克隆载体。 已知序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的，这样做实际上是为了实验结果的严谨。 PCR常见问题分析 无扩增产物 无扩增产物 PCR产物纯化 PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 确定DNA浓度： 1）marker说明上是否有标明条带的DNA浓度，如果有，那么根据电泳的条带亮度与marker亮度对比去估计DNA浓度 2）用分光光度计去测A260nm的OD值。如果测量OD值的话，你只要得到插入片段和载体的OD值比例关系就行了，因为具体计算的时候考虑的也只是比例而不是实际浓度。（载体片段和插入片段进行电泳的时候，能够看到清晰的条带。） 连接重要的注意事项： 1.载体总量 2.载体和插入片段比例 3.载体和插入片段质量。? 测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆， 反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低? 载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10。 Page ? * Page ? * pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。其原型质粒在使用上有优点。。pBR322是一种最常用、最基础的质粒。 因为如果