大肠杆菌蛋白表达体系构建实验报告.pdfVIP

大肠杆菌蛋白表达系统的构建与蛋白质的分离纯化  实验目的： 1.学会氯化钙制备大肠杆菌DH10B 感受态细胞及掌握质粒转化感受态细胞的操作方法 2.转化BL21(DE3)并在合适条件下诱导表达蛋白，掌握蛋白质诱导表达的原理，学习蛋 白质诱导表达的方法 3. 学会使用镍柱分离纯化蛋白质，利用PEPC 试剂盒测定PEPC 的活力。  实验原理： 1. 钙转法：Ca2+ 能与加入的DNA 分子结合，形成抗DNA 酶(DNase)的羟基-磷酸钙复 合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42 ℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液 晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA 分子提供了进入细胞的通道。 2. 诱导BL21(DE3)表达蛋白质的原理：E. coli BL21(DE3)其 DE3 是整合在细菌基因组 上的一种携带T7 RNA 聚合酶基因和lacI 基因的λ 噬菌体，lacI 编码的阻遏蛋白与lac 操纵 基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG 为乳糖类似 物，不能被细胞利用，可以特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因 大量转录并高效表达。 3. 六聚组氨酸纯化蛋白的原理：亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的相互作 用来分离物质的层析方法。 组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多 额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲 和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标 签是原核表达载体上6 个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0 时不带电,且无免疫原性,对蛋白质 的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化. 4. 目标蛋白：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 （Phosphoenolpyruvate carboxykinase ，PEPC. EC 4.1.1.32 ）是以一条单一肽链构成，相对分子质量为120kD 的一种激酶。在磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶的催化下，草酰乙酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。该反应消耗一分子的三 磷酸鸟苷以提供磷酰基。在糖异生作用中，此酶与丙酮酸羧化酶一起构成了从丙酮酸转化为 磷酸烯醇式丙酮酸的迂回步骤。 5. 表达载体：pET28a ，表达常用载体，图谱如 下  实验步骤： 1．感受态细胞的制备并利用试剂盒提取大肠杆菌质 粒 挑取单克隆过夜培养，转接，摇至OD600 等于 0.4，离心收集菌体，以0.4 倍体积ccc1 洗三次，至菌液呈乳白色，离心收集菌体，加入1/25 的ccc2 混匀，置于冰上（15 ~60 min ），分装，100 μL 每份，-80 ℃保存。同时用kit 试剂盒 提取大肠杆菌BL21(DE3)质粒。 2 ．转化 100 µL 的感受态细胞分成2 管，实验组将2 µL 重组质粒DNA 加入到50 µL 感受态细 胞EP 管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打) （标记P+ ）阴性对照组将2 µL 无菌水加入到50 µL 感受态细胞EP 管中，用枪头轻轻混匀(勿吹打) （标记P- ）；冰浴10 min ；热击42 ℃，90 sec， 静置，勿摇动；迅速放到冰上，冰浴2 min 。复苏：加入800 µL LB 液体培养基（无抗性）， 标明组号 （10 组），37 ℃，150 rpm 摇床，15 min ，复苏时，倒三块LB 平板（两块有抗性， 一块无抗性），涂布培养第二天中午观察结果。从平板上挑取单克隆划线扩大培养低温保存 (助教做) 3. 诱导 原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中，挑取单克隆，过夜培养（小摇）。取2mL 菌液 转接于50mL kana LB 培养基，摇床培养约1 小时至OD600=0.5 左右，开始诱导 。取1.5mL EP 管2 支，收集约3mL 未诱导菌液，备用。三角瓶中加入IPTG 100uL(0.5M)至终浓度为 1~2 mM，继续培养。37 摄氏度诱导3h 即可破碎细胞收集蛋白。取1.5mL EP 管2 支，收集 约3mL 诱导后菌液，备用。 4. 破碎菌体 每组取2 支预冷的50ml 离心管，每支离心管取约20ml 菌液，冷冻离心机4 ℃，3000rpm 离心10min。取10ml bufferA ，用枪吹打