濒危植物巴东木莲ISSR分子标记技术体系建立.pdfVIP

— 70 — 江苏农业科学 　2008年第 4 期 濒危植物巴东木莲 ISSR 分子标记技术体系的建立 李晓玲 , 温国莉 , 陈发菊 , 梁宏伟 , 何正权 (三峡大学生物技术研究中心 /天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北宜昌 443002) 　　摘要 : 利用正交设计建立和优化适合于濒危植物巴东木莲的 ISSR - PCR 分子标记技术体系 。对影响 ISSR 2 + - PCR 反应的多个因素 ,包括引物和 DNA 模板浓度 、Taq酶用量 、M g 和 dN TP s浓度以及 PCR 扩增的退火温度 、 退火时间及循环次数等进行了优化 。结果表明 ,适于巴东木莲 ISSR - PCR 反应的分子标记技术体系为 :反应总 μ μ μ μ μ μ μ μ 体积 20 l,含 2 l 10 ×buffer、1 l 20 mmo l/L M gCl 、4 l 2 mol/L 引物 、0. 4 l 10 mmol/L dN TP s、0. 8 l 5 U / l 2 Taq酶及 40 ng模板 DNA ; PCR 扩增程序为 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 30 s, 54 ℃复性 45 s, 72 ℃延伸 1. 5 m in, 35个循环 ,最后 72 ℃延伸 7 m in。本研究建立的 ISSR 分子标记技术体系稳定性强 ,重复性高 。 　　关键词 : 巴东木莲 ; ISSR; 分子标记 ; 正交设计 ; 优化 　　中图分类号 : Q943. 2　　文献标志码 : A 　　文章编号 : 1002 - 1302 (2008) 04 - 0070 - 04 ( ) 　　巴东木莲 M ang lietia p a tung ens is Hu 为木兰科 靶基因组中 SSR 的 5 或′ 3 末′端结合 ,对相距较近 、 ( ) M agno liaceae 木莲属植物 ,常绿乔木 ,是木莲属植 方 向相反 的 SSR 序 列之 间的 DNA 片段进 行扩 物分布的最北缘植物 [ 1 ] 。木莲属是现存木兰科植 增 [ 5 - 6 ] 。ISSR 比 RA PD 揭示更高的多态性 [ 7 ] 。由 物中的最原始的类群 ,也是研究木兰科植物系统发 于较 RA PD 使用更高的退火温度和使用更长的引物 育、分类及演化的关键类群 。我国南部和西南部地 序列 ,因此 ISSR 较 RA PD 更可靠 、更稳定 [ 8 - 9 ] 。此 区是该属植物的现代分布中心 。巴东木莲仅零星分 外 , ISSR 能够揭示物种间更多的遗传变异 , 能区分 ( ) [ 10 ] 布在湖北巴东和利川 、湖南桑植和大庸等地 。现有 亲缘关系很近的品种 系 。因此 ISSR 被认为是 种群和个体的数量少 ,加之在 自然状态下种子的繁 检测居群遗传多样性 、鉴定亲缘关系较近的物种及 殖能力差 ,林下幼苗极其罕见