SSR引物富集和设计方法.docVIP

一、研究材料与方法 1.样品的采集与保存 2.主要试剂 DNAeasy基因组提取试剂盒（Qiagen公司），限制性内切酶MboⅠ（Takara公司），生物素吸附剂Vectrex Avidin D(Vector Laboratories)，binding buffer(150 mM NaCl/100 mM Tris,pH=7.5)，PMD19-T载体（Takara公司），大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，琼脂糖（Gene Tech公司），胰蛋白胨（OXOID）,酵母提取物（OXOID），NaCL（国药集团化学试剂有限公司），Tris(上海鼎国生物技术有限公司)，冰乙酸（上海化学试剂有限公司），EDTA（北京鼎国生物技术有限责任公司），溴酚蓝、二甲苯氰（广州威佳有限科技公司），甘油（国药集团化学试剂有限公司），酚（国药集团化学试剂有限公司），异戊醇（国药集团化学试剂有限公司），SybgreenⅠ（北京鼎国生物技术有限责任公司）。 3.主要耗材 1.5 ml离心管（江苏省海门三和通东玻璃仪器厂），96孔PCR板（Axygen公司），枪头（江苏省蓝天仪器厂）。 4.主要实验仪器 移液器（Effendorf），台式离心机（Effendorf），电热恒温水槽DK-8D型（上海一恒科技有限公司），PCR仪（Biorad），电泳仪DYY-6C型（北京六一仪器厂），凝胶成像仪。 5.主要试剂和缓冲液的制备 DNA消化缓冲液：100mmol/L Tris-Cl，50mmol/L EDTA(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl，0.1% SDS50×TAE电泳贮存液/L（缓冲液为10×）：242 g Tris碱，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA凝胶加样缓冲液（Loading buffer）（10×）：0.25%溴酚蓝（或二甲苯氰），50%甘油。2%（1%）琼脂糖电泳胶：向100 ml 10×TAE电泳缓冲液中加入0.5 g（1%的胶加1 g）琼脂糖；微波反复加热沸腾直至溶液透明，冷却至60℃左右，向制胶槽倒胶。11 6.DNA的提取DNAeasy基因组提取试剂盒7.微卫星富集文库的构建与筛选 7.1基因组DNA的酶切 限制性内切酶MboⅠ酶切基因组DNA，37℃消化过夜，1%琼脂糖凝胶电泳，出现从小片段到大片段的连续图谱，凝胶回收试剂盒（Takara公司）纯化回收300～800bp的酶切片断。 7.2连接Linker与DNA酶切产物 用SAULA5′GCGGTACCCGGGAAGCTTGG 3′)和SAULB5′GATCCCAAGCTTC CCGGGTACCGC 3′) 互补制成的Linker使用T4 Ligase与DNA酶切产物16℃连接过夜。 7.3连接产物的扩增 以SAULA为引物对连接产物进行聚合酶链式反应扩增（PCR）。反应体系：SAULA（10μM）2μl，Premix Taq（Takara公司）25μl，模板DNA 2～5μl，用ddH2O将反应体系补至50μl。反应条件：95℃预变性5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s共30个循环；最后72℃延伸10 min。 7.4片段筛选 将PCR产物在1%琼脂糖电泳后切胶，使用凝胶回收试剂盒（Takara公司）回收400～900bp的片段。 7.5杂交 PCR纯化产物95℃变性5min立即冰浴5min，混合8μl生物素标记的（CA）15探针，12加磷酸钠缓冲液至800μl，杂交炉中杂交15h。 7.6吸附与洗脱 将杂交混合物与生物素吸附剂Vectrex Avidin D(Vector Laboratories)混合，用结合缓冲液(150 mM NaCl/100 mM Tris,pH=7.5)分别在37℃、50℃、65℃洗脱三次后，0.1倍的结合缓冲液65℃洗脱一次，最后60μl超纯水65℃洗脱并用Chroma Spin＋TE-400柱（Clontech）纯化获得单链DNA，PCR扩增获得双链DNA[68,69]，反应体系：SAULA（10μM）2μl，Premix Taq（Takara公司）25μl，模板DNA 10-20μl，用ddH2O将反应体系补至50μl。 反应条件：95℃预变性5 min；94℃30 s，52℃30 s，72℃30 s共30个循环；最后72℃延伸10 min。将PCR产物在1%琼脂糖电泳后切胶，使用凝胶回收试剂盒（Takara公司）回收400～900bp的片段。 7.7克隆 双链DNA与PMD19-T载体（Takara公司）连接，转化到大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞，37℃摇床培养1 h，菌液涂于含IPTG、X-Gal的氨苄青霉素抗性LB平板上，37℃培