分子终结者2003.docVIP

PCR 基本原理：理论原理：DNA半保留复制的理论，DNA双链在不同温度下变性与复性的特点。实验原理：变性：模板DNA双链在9变性解链单链⑵退火：温度降至55℃左右，引物与单链模板的3’端互补⑶延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，PCR效率：每次循环产物都可以作为下次循环的模板，扩增呈指数级放大。30次循环后出现平台效应，获得大量特异性PCR扩增产物。PCR 高度的灵敏性：理论上经 20 循环可将目的基因片段扩增 220＝1000000 倍。高度的特异性：利用引物与模板的特异性配对，可保证扩增的特异性。一对 20 碱基长引物的多样性为440＝1024。应用的广泛性：目前已经成为分子生物学研究必不可少的手段。操作的简便性：不需要复杂的设备和繁琐的流程PCR 系统组成：酶：Taq DNA 聚合酶。模板DNA：可以为基因组 DNA 或 cDNA。引物：人工合成的寡核苷酸片段。dNTP：聚合反应的核苷酸单体。缓冲液：包含特定的 pH、离子强度和 Mg2+。反应程序：变性、退火、延伸组成的循环。仪器：热循环仪， PCR 仪。 模板 DNA：（1）PCR 反应的模板可以是基因组 DNA，也可以是 cDNA(逆转录-PCR，RT-PCR)。（2）在利用 DNA 为模板进行扩增时并不一定要进行 DNA 的分离和纯化。 血液、病原体、体外培养细胞、甚至病理标本的经简单处理后均可直接进行 PCR 扩增。（3）RNA 样品一般要经过纯化，并逆转录。 未经纯化的 RNA 不稳定，无法进行逆转录。反应体系中如果存在 DNA，将对 RNA 的扩增产生干扰。 影响变性温度的因素：溶液的离子强度。变性温度与离子强度正相关，低盐利于变性。DNA分子的 GC 含量。GC％＝(Tm－69.3)×2.24。 定量 PCR：（1）利用 PCR 方法对模板 DNA 或 cDNA 进行定量测定。（2）定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的检测。（3）常规RT-PCR 方法用于基因表达水平检测。 PCR 产物的量与起始的模板 DNA 量有关。定量是相对的，一般不准确。实时荧光PCR:不以 PCR 反应到达终点时产物的量为定量标准，而以产物量到达一定阈值所需要的循环数为定量标准。要求对 PCR 产物的生成量进行动态监控。需要荧光标记的探针与两侧 PCR 引物。探针标记有报告荧光与粹灭荧光。在 PCR 反应过程中探针被降解，报告荧光显色。可通过专用仪器进行实时监控。 核酸分子杂交原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中各分子间键的形成和断裂。杂交双方是待测核酸和已知序列。 Southern 印迹杂交：指DNA片段转移到膜上后与DNA或RNA探针进行杂交，检测靶DNA片段中是否存在于探针同源的序列。步骤组织（细胞）基因组DNA的制备限制性内切酶酶切电泳分离变性、转移并固定于膜上（固相支持物）与标记探针杂交杂交结果检测与分析。关键步骤是：DNA的酶切消化和基因探针的标记。Western blot：是一种免疫印迹技术，基本原理与核酸分子杂交技术相似，利用抗原抗体特异识别并结合的特点，以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 ①cDNA探针:通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。②基因组探针:从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。③寡核苷酸探针:根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。 DNA 芯片技术：就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。 基因:能够表达和产生蛋白质和RNA的DNA序列，是决定遗传性状的功能单位。基因组:细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。操纵子:是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。 病毒、原核、真核、人类基因组的特点：病毒:①不同病毒基因组大小相差较大。②不同病毒的基因组核酸本质不同，每种病毒只含有一种核酸。③基因组编码序列大于90%。④单拷贝基因组（逆转录病毒基因组有2个拷贝）。⑤基因有连续和间断之分：病毒基因结构特征往往是与其宿主细胞的基因结构相类似。⑥相关基因丛。