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国家重大科学研究计划项目年度总结报告 项目名称：发育过程中形态发生素梯度形成和信号转导的调控机制 课题编号：2011CB94390课题名称：课题： 年度计划执行情况 1. 年度计划完成情况 1.1对照课题一在本年度的研究计划，我们通过全基因组RNAi文库等多个文库进行体内全基因组大规模遗传筛选，筛选并鉴定出8个Wnt/Wg信号通路相关的新基因（Sec22，Sys1，éclair，CHOp24，Baiser，Su(dx)，USP8，DSNX3）；找到了与Retromer对Wnt分泌调控相关的SNX分子(SNX3)，揭示出Retromer对Wnt分泌的调控机制，研究论文发表在Cell Research 上。 1.2通过研究蛋白激酶Nek2、Smi35A和Lic在体内和体外对Wnt通路以及其它通路产生的影响，确定了Nek2对Wnt信号通路的强烈促进作用，Smi35A对Wnt信号通路的微弱促进作用，和Lic对Wnt信号通路的强烈抑制作用。同时确定了Lic对Hippo信号通路的抑制作用。 2. 研究工作的主要进展 2.1 发现驻留在内质网的SNARE蛋白Sec22，定位在高尔基体的4次跨膜蛋白Sys1，以及P24蛋白家族成员Eclair, CHOp24, Baiser, 参与Wg分泌的调控，其基因缺失的果蝇翅成虫盘中Wg蛋白分泌水平降低，Wg在细胞内积累。 2.2 发现SNX家族成员SNX3通过调控Retromer复合物介导的Wntless回收，参与控制Wnt/Wingless蛋白的分泌的分子机制。 2.3 发现Su(dx)作为E3连接酶参与Wls泛素化修饰，USP8作为去泛素化酶参与Wls去泛素化修饰，两个蛋白共同调控Wls在细胞中的稳定性和蛋白水平，从而影响Wg分泌。 2.4 通过蛋白质组学研究，我们发现了Nek2调控Wnt信号通路的靶蛋白Dsh，证明了Nek2通过对Dsh的磷酸化修饰增强Dsh的活性，从而促进Wnt信号在细胞内的传递。 2.5 我们进一步发现，Nek2能同时对Dsh的两个区域进行磷酸化修饰。通过质谱分析，我们已经确定了其中一个区域的磷酸化位点。 2.6 我们同时发现，Nek2对Wnt通路的关键调控因子Armadillo也存在磷酸化调控，并确定了磷酸化修饰的区域以及该修饰对Armadillo蛋白稳定性的影响。 3. 如有重要阶段性成果或突破，请重点阐述（每项300-500字），另附图片。 重点阐述SNX3通过调控Retromer复合物介导的Wntless回收，参与控制Wnt/Wingless蛋白的分泌的分子机制。 在以前的研究中，我们发现Retromer复合物通过把Wls蛋白从内吞体运回到高尔基体而维持Wls的水平，从而调控Wg/Wnt蛋白的分泌。鉴于在Retromer锚定于囊泡膜的过程中需要SNX分子参与，我们分别敲除了果蝇snx家族八个基因，发现Dsnx3的缺失影响Wg信号活性。经果蝇体内实验以及培养细胞体外实验证明，DSNX3的缺失会特异性地造成Wg 在分泌细胞内累积，说明DSNX3特异性地参与 Wg的分泌调控。深入研究发现SNX3参与了Retromer复合体对Wls逆向囊泡运输过程，并通过影响Wls的稳定性来调控Wg的分泌；DSNX3分子中PX结构域中PI3P结合区对于DSNX3发挥功能至关重要；而DSNX1和DSNX6与Retromer介导的Wg分泌无关。 此项工作阐明了DSNX3通过调控Retromer介导的Wls回收来选择性地控制Wg的分泌，将我们对Retromer 作用于Wg/Wnt分泌过程的发现进一步扩展，即独立发现一个新的分子——SNX3参与此通路的调节，为最终揭示Retromer复合物调控Wls稳定性及Wg/Wnt分泌的分子机制推进了一步，成果发表Cell Research上。 图1 Dsnx3的缺失影响Wg信号活性 课题执行过程中存在的问题及其对策。 通过蛋白质组学和酵母双杂交研究Smi35A和Lic的调控机理时，未找到明确的靶蛋白。我们将通过遗传学的epistasis分析细化这两个基因在Wnt信号通路中调控的位置，从而优化蛋白质组学的条件。 下年度研究工作计划和进度安排。 进一步研究新基因sec22, Sys1, éclair, CHOp24, Baiser等基因参与Wg分泌调控的作用机理，确定其在信号通路中的作用机制，整理实验数据，发表相关论文。 深入研究Su(dx)和USP8对Wls泛素化修饰的分子机制，整理实验数据，发表相关论文。 进一步筛选其它参与Wg分泌以及信号调控的新基因。 确定Nek2调控Dsh的另一个磷酸化位点，和Nek2调控Armadillo的磷酸化位点，确定这些磷酸化调控的功能，准备文章发表。 找到Smi35A和Lic调控Wnt信号通路的靶蛋白，研究其调控机理。