一种新颖简便荧光实时RT-PCR相对定量方法建立.pdfVIP

2005；32(9) 生物化学与生物物理进展 Prog．Bi∞hem．Ⅸ0phys． · · 883 一种新颖简便的荧光实时RT．PCR 相对定量方法的建立毋 张驰宇“徐顺高黄新祥 (江苏大学医学技术学院，镇江212001) 摘要为建立一种新颖、简便的荧光实时RT．PcR相对定量方法，根据实时定量标准曲线，推导出相对定量基因 表达的公式．公式显示相对表达指数只与cT值和标准曲线的斜率相关．构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外 转录获得，实验过程繁琐．当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时，标准曲线的斜率并不改变，说 明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关．因此，新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总砒蛆(或 cDNAl，经系列稀释后作为标准品，来构建相对定量标准曲线，获得斜率．与绝对定量法比较，新方法获得了基本 一^^r 相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4％)，而传统的2…’法却表现出较大的定量误差．这些结果表明，新 的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法． 关键词荧光实时定量R■PCR，相对定量，绝对定量，标准曲线，rnl悄A定量，斜率 学科分类号0781 基因表达的定量已被广泛应用于生物医学研究 达时，需要利用已知拷贝数的标准品来构建标准曲 线．根据目的基因和参照基因的标准曲线，可以获 的许多领域．荧光实时定量RT．PcR技术能够实时 检测记录PCR扩增产物的增加，克服了终点法定 得cT与初始拷贝数对数值之间的一阶方程： 量PCR产物的不足，使准确定量RNA成为现 cT．，=AT·XT+研 (1) 实[1，2】．目前荧光实时RT—PCR定量基因表达常采用 CTIR=AR·XR+曰R (2) 两类方法，即绝对定量和相对定量．绝对定量法准 T和R分别代表目的基因和参照基因，则岛 确，但需要先克隆一段目标基因，构建体外对蛆 和cTR分别代表目的基因和参照基因的cT值；x 合成载体，在砒妊聚合酶存在下，合成大量 代表初始拷贝数的以lO为底的对数；A和B分别 RNA，用作标准品构建标准曲线【l，3】．相对定量通常代表一阶方程的斜率和截距． 以表达恒定的看家基因作为参照，来获得目的基因 因此，目的基因和参照基因mRNA的定量结 相对于参照基因的表达指数．实验组与正常对照组 果可以分别表示为： 目的基因表达指数的比值就代表目的基因的相对表 1=10…… pflO (3)(3) pfl^l严刚1 达量，反映实验组基因表达的变化情况刚． 0(‰坷渺8 (4) 绝对定量能够获得基因表达的准确量，但针对 Q。：1矿|1 不同的目的基因，需要构建不同的标准品，大大增 Q，和QR分别代表目的基因和参照基因II心A 加实验的难度和复杂性[3】．传统的相对定量方法是 的绝对拷贝数． 2～7，其操作简单，但因为将PCR的扩增效率设 定量目的基因表达时，常用一些看家基因作为 定为1，而实际PCR的扩增效率难以达到1，且目参照，对目的基因的表达进行标准化，使结果具有 的和参照基因的扩增