小麦cDNA文库构建.pdfVIP

小麦 cDNA 文库构建 生物技术 51 班 财务预算，课件制作：刘巍 1135107 邢涛 1135108 实验指导教师：卢亚萍 一、实验目的 由mRNA反转录获得的cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达， 因此，可以从 cDNA 文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。 通过构建 cDNA 表达文库可用于濒危珍稀生物资源保存，提供构建分子标记连锁图谱的 探针，也可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。cDNA 在个体发育、细胞分化、细胞 周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作 中最常使用的基因文库网。 二、实验原理 1、1、 植物总植物总 RNARNA 提取提取 11、、植物总植物总 RNARNA 提取提取 RNase 是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能 使其完全失活。在提取RNA 实验中，要尽量抑制 RNase 的活性。 DEPC（焦磷酸二乙酯）是很强的RNase 抑制剂，可以使 RNase 的活性丧失。实验中使用 的 枪头、 EP 管、溶液都要利用 0.1%的 DEPC 处理，Tris 不可以用DEPC 处理。耐高温的玻 璃器皿等要在 250℃烘烤 4 小时以上。内源的RNase 一般利用蛋白质变性剂除去。如苯酚、 氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。无水乙醇、高浓度的盐溶液和异丙醇中可以沉淀 RNA 或 DNA，前两者利于沉淀大片段的核酸。 利用 mRNA 3’末端含有 Poly（A+）的特点，在 RNA 流经寡聚 （dT）纤维素柱时，在高 盐缓冲液的作用下，mRNA 被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏 水的情况下，mRNA 被洗脱，经过两次寡聚 （dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 2、 cDNAcDNA 合成及扩增合成及扩增 ccDNADNA 合成及扩增合成及扩增 反转录酶主要用于体外 cDNA 的合成。目前最常用的反转录酶(reverse transcriptase) 有 SuperscriptII、M-MLV 和 AMV 等。它们具有依赖于 RNA 或 DNA 的 DNA 聚合酶活性和 RNaseH 酶活性，可以以 RNA 分子为模板，合成出一条DNA 链。形成的 DNA 是与 RNA 模板互补的，因 而反转录产生的 DNA 分子称之为 cDNA。 cDNA 第一条链合成 采用与 mRNA 杂交的引物，在反转录酶的作用下进行 cDNA 第一条链 的合成。cDNA 第一条链的合成起始于能与 mRNA 杂交的引物 。常用的引物有两种， (1)Oligo-dT，可与mRNA 分子的 3′末端的 polyA 序列结合，形成有效的引物；(2)为 6 聚体 寡聚核苷酸随机引物，该引物可在第一条链合成时起始于 mRNA 的许多部位，可以保证能得 到囊括 mRNA 的编码区及 5′末端的序列。第一条链的合成率并不很高，产量最高可达模板 mRNA 的 50%。可通过参入 α-32P-dCTP 计算合成的效率。 公式为：第一条链合成pg=参入第一条链 cpm 总 cpm×合成 DNA 的总量 cDNA 第二条链合成 cDNA 第一链合成反应完成后，得到 DNA  mRNA 杂交分子，在 DNA 聚合酶的作用下，以第一条链为模板，合成 cDNA 的第二链。 目前PCR 法合成 cDNA 第二链已在诸多领域得到较为广泛的应用，并已成为分子克隆的 一种主要手段。以合成的 cDNA 第一链为模板，设计合成一组引物，采用 PCR 扩增技术得到 多拷贝的双链 cDNA 的方法。 基于 PCR 方法的高效扩增作用，这种第二条链的方法的特点是： ① mRNA 不需要纯化，总 RNA 既可作为 cDNA 的一条链的模板； ② ②由于此方法是通过在 cDNA 第一条链的 3′末端同聚物加尾而形成的，不损失其末 端的最后几个核苷酸，因而可得到相当于 mRNA 5′端得较为完整的序列。 所得到的是包含已知序列和未知序列的 cDNA 群体。在合成 cDNA 第二条链时，应考虑下 一步双链 cDNA 分子与载体连接、载体的选择及克隆。 3、 载体构建及转化载体构建及转化 载体构建及转化载体构建及转化