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纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1. 纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸4.4无水葡萄糖4.5四水酒石酸钾钠(分析纯)4.6氢氧化钠(分析纯)4.7重蒸苯酚(分析纯)4.8无水亚硫酸钠(分析纯)4.9叠氮化钠(分析纯)4.10羧甲基纤维素钠5.0仪器5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃5.3 722型分光光度机计5.4分析天平感量0.1㎎5.5一级玻璃制品5.6电冰箱6．0试剂的准备6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8）溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。6.2 DNS试剂:溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。7．0标准曲线制作：7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。7.3标准葡萄糖曲线制作 取1mg/ml标准葡萄糖液各0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml补加水至2.0ml,加入2.0mlDNS试剂,具塞,沸水浴中加热10分钟,冷却后定容至15ml,分光光度计550nm波长下测OD值,3次重复实验的均值用最小乘法相拟合Y=ax+b一元线性方程。由光密度值引得葡萄糖量。8.0 CMC酶活性测定。8.1活性定义：1g酶粉（1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个CMC酶活力单位。8.2分析程序： 取三支15ml刻度试管分别加入0.2ml稀释酶液，在分别吸取1.8mlCMC溶液,50℃水浴保温30分钟,空白样用0.2ml稀释酶液,加入1.8ml醋酸缓冲液,同样50℃水浴30分钟,再吸取DNS2ml摇匀后,具塞,沸水浴反应10分钟,冷却后,补加水至15ml,轻轻上下摇匀,用空白调零点,于550nm下测OD值。9.0计算活力单位 A×D×5×1000 CMC酶活力=————————μ/g(ml) 30 A：OD值在标准曲线上对应的葡萄糖量（）D：酶粉（液）稀释倍数 2. FPA酶 即滤纸酶，即以滤纸作为底物，因滤纸中的纤维素含量较高，FPA酶水解滤纸中的纤维素，释放出的还原糖与3.5-乙硝基水扬酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原糖量成正比关系，即与酶样品的酶活性成正比关系。通过在550NM的光吸收值查对标准曲线，可以确定还原糖产生的量，从而确定酶活力单位，它也是恒量纤维素酶活的一个重要指标。 3. 半纤维素酶： 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸测定半纤维素酶活性单位2.0范围 生产分析和质量控制部门适用3.0原理 半纤维素酶水解木聚糖，释放出的还原糖（以木糖计）与3.5一二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。4.0单位定义 一个半纤维素酶单位定义为；1g酶粉（或1ml酶液）于50℃PH4.8条件下，每分钟分解1%木聚糖溶液产生一微克还原糖（以木糖）的酶量定义为一个半纤维素酶活力单位。5.0试剂 5.1无水醋酸钠（分析纯）5.2冰醋酸（分析纯）5.3 3.5一二硝基水杨酸（分析纯）5.4木糖（分析纯）5.5四水酒石酸钾