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菌落总数与大肠菌群数测定 主要内容 水样的采集与送检 菌落总数测定 大肠菌群测定 MPN法原理（拓展内容） 水样的采集和送检 采样瓶：洗净、包扎、灭菌 自来水：烧灼龙头，放水5-10min 中和余氯：每500ml水样，预加1.5% Na2S2O3 2ml 水源水：距水面10-15cm 送检时间：=2h(常温) ，=4h(冷藏) 采样瓶 烧灼水龙头 菌落总数测定 实验目的 掌握菌落总数测定方法 实验原理 不同稀释度的水样，营养琼脂培养基，37 ℃，24h，菌落数 菌落总数测定 器材与试剂： 水样，无菌蒸馏水，营养琼脂培养基，1ml吸管，10ml吸管，平皿 菌落总数测定 实验步骤 1.稀释水样： 10ml水样加入90ml无菌蒸馏水、 振荡、彻底混匀 2.做1：10系列稀释 三支9ml无菌蒸馏水试管 3.倾注培养 1ml稀释水样、15ml培养基（45 ℃） 4.倒置培养：37 ℃，24h 倾注培养 培养结果 菌落总数测定 实验步骤 5.菌落计数： 肉眼观察，可用放大镜，可标记 必要时分区计数，菌落成片者作废 计算方法 某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值 选择菌落数在30-300之间的稀释度 （1）仅有一个稀释度在此范围： 菌落数×稀释倍数 菌落总数测定 计算方法： （2）有两个稀释度在30-300之间 菌落数之比2，选较小值 菌落数之比2，取平均值 （3）所有稀释度均300 取稀释倍数最大者 （4）所有稀释度均30 取稀释倍数最小者 （5）没有任何稀释度在30-300之间 选最接近该范围者 结果单位：CFU/ml 菌落总数测定 注意事项： 1.无菌操作 2.标记 3.何时更换吸管 4.吸吹混匀 5.琼脂培养基保温 6.安全常识 大肠菌群数测定 实验目的 实验原理 37 ℃，24h，乳糖，产酸（溴甲酚紫），产气（小倒管） 三步法：初发酵、分离培养、复发酵 器材与试剂 水样、无菌蒸馏水、乳糖蛋白胨培养基，伊红美蓝培养基，革兰染液 1ml吸管、10ml吸管、试管、平皿、载玻片 初发酵 器材与试剂 水样、90ml无菌水、9ml无菌水、5ml三倍乳糖蛋白胨，10ml吸管、1ml吸管、酒精灯、吸球 大肠菌群数测定 实验步骤： 1.初发酵 （1）10ml水样+3倍乳糖蛋白胨培养液（5ml） （2）三个稀释度（原水样，1:10和1：100）， 各取1ml+乳糖蛋白胨培养液（10ml） （3）培养：37 ℃，24h （4）观察指标： 产酸（黄色），产气（倒管内有气泡） 吸取水样 加注水样 初发酵结果 左2为阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生。 大肠菌群数测定 实验步骤 2.分离培养 （1）制备伊红美蓝平板： 45 ℃，无菌，倾注，15ml （2）选产酸产气的发酵管 （3）接种至伊红美蓝平板 分区划线法 （4）培养： 37℃，24h 分离培养 器材与试剂 初发酵结果（4只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基 分区划线法 操作要点 1.划下一个区前必须灭菌接种环 2.划线时接种环同平板呈30-40°角 3.每次划线应该压到上一个区域的2-3条线 4.用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动 大肠菌群数测定 实验步骤 2.分离培养：  （5）菌落特征： 深紫黑色、有金属光泽 紫黑色、无或略有金属光泽 淡紫红色、中心颜色深 （6）革兰染色、镜检：选特征菌落 革兰