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醋酸纤维薄膜电泳分离人血清蛋白质 郑州轻工业学院 王 章 存 一、实验目的 了解电泳技术的一般原理 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作 二、实验原理 1.电泳：是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 在一定pH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离 2. 影响电泳迁移率的因素： 内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象 3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点 4. 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 三、实验器材 1. DYY-6C型 ?双稳定时电泳仪和DYY-Ⅲ型电泳槽，均为北京市六一仪器厂生产 2.醋酸纤维薄膜（2 cm×8cm）：2片/人。 3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。 4.点样器：一个/组。 5.滤纸：公用。 6.玻璃板：一块/组。 7.镊子：一个/组。 8.玻棒：公用。 四、实验试剂 1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.07 mol/L，离子强度0.06)：称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定溶至1000ml。置4℃保存，备用。 2、0.5% 氨基黑10B染色液：称取0.5g 氨基黑10B，加蒸馏水40ml，甲醇（AR）50ml，冰乙酸(AR)10ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。 3、漂洗液：取95% 乙醇（AR）45ml，冰乙酸（AR）5ml和蒸馏水50ml， 混匀置塞试剂瓶内贮存。 操作指南：电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，，两者之间有专门的连线连接。。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通电，调整好电压，进行电泳。注意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前，该电泳仪已改进为数显式的DYY-6C型。 五、实验操作 1. 醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，每组取醋酸纤维素薄膜1张，取时用镊子夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用它吸干表面液体。 2. 电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 3.点样： 点样时，先将毛细血管插入血清中，封住上端，在载玻片的一端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下。点样区距阴极端1.5cm处（见图）。此步是实验的关键。  醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置） 4.电 泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度（24片薄膜则为14.4mA）。通电5min后，调节电流强度0.5mA/cm膜宽度（24片薄膜则为24mA） ，电泳时间50min。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。 5.染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5 min 6.漂洗： 将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。 7. 记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出, 放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1．为清蛋白，2，3，4，5，分别为α1—，α2—，β—，及γ—球蛋白，6为点样原点 六、注意事项 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸