大肠杆菌感受态细胞的制备.doc

大肠杆菌感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出不同的方法处理细菌，经过多年的努力，科学家们发现了可以增加细胞吸收外源DNA效率的方法，那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种经过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，该细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。对于E.coli，目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。其中，电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。其转化效率为109～1010 转化子/μg DNA。而对于热激法，是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。一、CaCl2感受态细胞的制备CaCl2感受态细胞的制备实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4下3000 g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4下3000 g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70）。以上是基本步骤，基本同“分子克隆指南”，具体的体积（一次制作感受态细胞的量）由个人根据实际情况掌握，不一定要死守以上的体积，但要保持试剂、菌体等量的平衡。提高感受态效率的关键如下述――注意事项：1.克隆的新鲜程度，一定要选新鲜平板的单克隆，即刚涂布生长过夜的平板；2.菌体的OD600值，JM109或BL21，OD值为0.35，DH5α为0.4，要尽量保证OD值不要过高，更不能超过0.6；3.低温处理的时间，做完后冰上保存12到24h后分装，并保存于－80；4.试剂和用品，非如果有可能，所有的用品（离心管、摇瓶等等）用新的，如果使用旧的，要确保干净，CaCl2溶液要过滤除菌，不要高压灭菌。二、电转感受态细胞的制备1、 -80冰箱保存的菌种在SOB固体平板上划单菌落；2、次晨，挑选单克隆感至内含1ml SOB液体培养基的试管中，37，300rpm，6 hr；3、然后转接到含400ml SOB液体培养基的2L摇瓶中（按1:500的量转接），300rpm，4hr，然后每隔2 min测一次OD600，至OD600=0.76；4、立刻置冰水浴中骤冷，可以选择在一个大的装有冰水混合物的容器里快速旋转摇动内有培养物的三角瓶，尽快使培养物温度降下来；5、随后在250ml预冷的离心杯中离心，4，2000 g，10 min；6、弃上清后，用预冷的水（灭菌的重蒸水）洗：先加少量水悬浮菌体（具体办法：在一个大的装有冰水混合物的容器里旋转摇动离心杯使菌体悬浮），菌体悬浮后再把水加满，2200 g，10 min，弃上清；7、再用10%的甘油同样方法洗两次，2400 g，10 min；8、最后一次倒尽甘油后（尽量去干净），用残存在管底的甘油悬浮细胞，每120μl分装到1.5 mL Ep管（EP管要-70度预冷），用-70的乙醇迅速冰冻；9、保存在-80冰箱中备用。以DH10B为例说明：步骤1：每次做感受态都要新鲜划菌，不要使用保存