杆状病毒表达蛋白.docVIP

杆状病毒表达蛋白 1 donor vector的构建 1.1 外源基因的连接 1.2 转化 1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。 1.2.2 冰浴30min。 1.2.3 42℃，90s。 1.2.4 马上放入冰浴中，2min。 1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。（LB 37℃预热） 1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。 1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。 1.3 鉴定 1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。 1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。 1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。 1.3.4 取1ml菌液测序。 1.4 菌种的保存 1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。 1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。 1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。 1.4.4 -80℃保存。 2 转座 2.1 转座反应 2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。 2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。 2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。 pFastBacTM construct 1ng(5μL) pFastBacTM control 1ng PUC19 control 50pg 2.1.4于冰中放置30min。 2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。 2.1.6 马上放入冰浴中，2min。 2.1.7 加入900μL室温LB培养基。 2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。 2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。 2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。 2.2 鉴定 2.2.1 挑取10个克隆于新鲜配制的LB平板中，画线，37℃倒置培养过夜。 2.2.2 挑取单菌落于LB液体培养基中，LB液体培养基含有50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet。 2.2.3 Bacmid DNA的提取，提取方法见附录3。 2.2.4 Bacmid DNA的PCR鉴定 由于Bacmid DNA中含有M13的正向及反向引物序列，在转作子两端，所以可以用M13来扩增鞭毛蛋白基因。 M13 Forward :5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3 M13 Reverse :5-CAGGAAACAGCTATGAC-3 反应的条件为：93℃ 3min，（94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 5min）℃ 7min。 2.2.5 取5-10μL PCR产物，0.7%琼脂糖电泳检测片段的大小，正确的片段大小为4000bp。 3 Bacmid DNA转染sf9昆虫细胞获得杆状病毒 3.1 sf9昆虫细胞的培养（见附录4）。 3.2 Bacmid DNA 转染sf9昆虫细胞 3.2.1 在6孔板中，每孔铺9×105个细胞，加入2ml含有抗生素（50u/ml的青霉素，50μg/ml的链霉素）的sf-900II SFM培养基。 3.2.2 27℃至少培养1hr。 3.2.3 在灭菌管中混合Cellfectin及DNA。 将1μg DNA在100μL的sf-900II SFM培养基中稀释；将Cellfectin上下颠倒混匀5-10次，取出6μL，用100μL的sf-900II SFM培养基稀释；将稀释的DNA及Cellfectin混合，温和混匀，室温放置15-45min。 3.2.4 移去细胞中的培养基，加入2ml sf-900II SFM培养基洗涤，弃去洗涤液体。 3.2.5 在DNA：Cellfectin混合物中，加入800μL的sf-900II SFM培养基，温和混匀，加入细胞中。 3.2.6 27℃，培养5hr。 3.2.7 移去DNA：Cellfectin混合物，加入2ml含双抗的sf-900II SFM培养基。 3.2.8 27℃培养72hr，直到看到杆状病毒的标志。 如果转染效率高，72hr后就可看到细胞病变，如果转染效率不高，4-5天后才能看到。 转染后的细胞病变： 转染24hr后 细胞直径变大，细胞核填充了整个细胞 转染24-72hr后 细胞停止生长，有粒状物出现，细胞表面出芽，出泡。 转染72hr后 细胞裂解 3.2.9如果看到上述的细胞病变，将2ml的细胞收集于15ml的snap-cap管中。 3.2.1