2015生物工程技术分子生物学实验.docVIP

实验一：实验试剂及器材的准备和注意事项的介绍 1.介绍整个实验的流程，了解分子生物学实验的连续性。 2. 学习实验中，将要使用到的各种仪器，及注意事项。同时，要求熟记实验中各种有毒试剂，及防护知识。 3.配制LB培养基，准备枪头及离心管，并灭菌。同时掌握后续实验将使用的各种溶液的配制方法，如抽提质粒的溶液I、II、III，及TE等。 注意所用试剂，及各个实验原理，请参考实验教材。 实验二：质粒DNA 的提取 安排几个同学，在实验前一天晚上，来接菌培养 1、取1.5ml培养物倒入微量离心管中，12000rpm离心1min吸去培养液，使细胞尽可能干燥 2、将细菌沉淀悬浮于100μl溶液I中，充分混匀。 3、加200μl溶液II（新鲜配制），盖紧管口，混匀后冰上放置3min。 4、加入150μl溶液III，盖紧管口，颠倒数次混匀，冰上放置5min 12000rpm，离心5min，将上清转至另一离心管中 5、向上清中加入等体酚：氯仿（:1:1）混合液，反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中。（考虑酚、氯仿有挥发性，且毒性大，根据本实验的要求，该步骤可以不用做。） 6、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5~10min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体。 7、用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，颠倒数次混匀并离心12000rpm 1min，倒去上清，（注意可用枪头将液体尽量吸干后再）自然干燥 8、加20μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解。 放入-20°C冰箱保存待用。 实验三：细菌染色体DNA的提取 安排几个同学，在实验前一天晚上，来接菌培养 （可以不用溶菌酶、与蛋白酶K） 1、收集适量新鲜的菌体用无菌水洗菌体一次，弃上清沉淀中加破菌缓冲液300μl，然后 60℃ 1小时，每隔一段时间拿出来轻弹一下，使浓度均匀。 -20℃预冷分钟，1000rpm离心分钟取上清液加等体积饱合酚混匀，1000rpm 5分钟离心取上清液上清液再加等体积饱合酚：氯仿＝1：1混匀，1000rpm 5分钟离心取上清液上清液再加等体积氯仿混匀，1000rpm 5分钟离心取上清液。加3M NaAc（pH5.2）μl 混匀，-20℃预冷分钟，1000rpm离心分钟 70％乙醇重悬，1000rpm 5分钟离心后自然烘干，沉淀溶于2μl的TE。°C保温2小时。 3、在一灭菌新酶切管中依次添加ddH2O 11.5μl、总DNA15μl、Buffer H 3μl、EcoR I 0.5μl，总反应体系30μl。混匀添加物后，放入37°C保温6-8小时。 4、取出酶切产物，电泳检测酶切效果。(可以放在-20℃保持，下次检测) 实验六：琼脂糖凝胶中回收线性DNA及检测 （一）质粒DNA酶切回收 1、凝胶电泳后，在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶。 2、称量凝胶重量，以1mg=1μl换算凝胶体积。 3、加入3倍凝胶体积的Buffer DE-A。 4、悬浮均匀后于75°C加热8min，每隔2~3min混合一次，直至凝胶块完全融化。 5、按Buffer DE-A体积的50%加入Buffer DE-B，混合均匀。 6、将DNA-prep Tube置于2ml Microfuge Tube中，将步骤5中的混合液移入DNA-prep Tube中， 5500rpm离心1min。 7、弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，加入500μlBufferW1，5500rpm离心1min。 8、弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2ml Microfuge Tube中，加入500μl已加无水乙醇的BufferW2，5500rpm离心1min，弃滤液，以同样的方法再用500μl BufferW2洗涤一次。 9、弃滤液，将DNA-prep Tube置于原2ml Microfuge Tube中，12000rpm离心1min 10、将DNA-prep Tube置于一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加入25~30μl Eluent或ddH2O，室温静置1min，12000rpm离心1min，洗脱DNA 11、凝胶电泳检测回收效果 （二）总DNA酶切回收 1、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5~10min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体 2、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清，自然干燥 3、加20μl TE缓冲液，使DNA完全溶解 4、凝胶电泳检测抽提结果，剩下的DNA放-20°C冰箱保存。 实验七：DNA酶连重组与转化 1、将酶切回收的质粒SK和总DN