定点突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶.pdfVIP

江苏农业科学 2013年第4l卷第8期 ～ 53一 季俊杰，张红梅．定点突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶[J]．江苏农业科学，2013，41(8)：53—54 定点突变改造棒状链霉菌青霉素扩环酶 季俊杰 ，张红梅 [1．中国矿业大学(北京)化学与环境工程学院，北京 100083；2．中国科学院大学，北京 ．100049] 摘要：利用定点突变技术对ScDAOCS进行改造，得到3个突变体 Q166E、D28E、M73I，生物活性检测和比活力数 据表明2个突变体 D28E、M73I的催化活性提高，为7一ADCA的合成提供了技术支持。 关键词 ：定点突变；青霉素扩环酶；棒状链霉菌 中图分类号：Q933 文献标志码 ：A 文章编号：1002—1302(2013)08—0053—02 头孢菌素作为卢一内酰胺类抗生素类被广泛应用于治疗 切 1h，酶切产物转化E coliBL21(DE3)，对得到的克隆进行 各种细菌感染。棒状链霉菌青霉素扩环酶 (Streptomycescla— DNA序列测序，筛选得到构建正确的突变体表达质粒。 vuligerusdeacetoxycephalosporinCsynthase，ScDAOCS)催化青 1．2．2 菌体的培养与青霉素扩环酶的诱导表达 突变体建 霉素中的五元噻唑环扩环生成六元噻嗪环，是实现生物法转 立以后，提取质粒转化至E．coliBI21中，将转化的克隆挑至 化青霉素、生产多种半合成头孢菌素中间体7一氨基一3一脱 3mLLB液体培养基 (kanamycin终浓度为50 g／mL)，37℃、 乙酰氧基头孢烷酸 (7一ADCA)的关键酶…。由于野生型青 220r／min摇床培养，培养至D60o =1．0左右时按照1％接种 霉素扩环酶的天然底物青霉素N不能大规模工业合成，而对 量转接至 10mLLB液体培养基 (kanamycin终浓度为 大量存在的青霉素G的转化活性又很低，我们利用定点突变 5O g／mE)，37℃、220r／min摇床培养至 D鲫l =0．6—0．8 的方法对改酶进行改造，以提高其对青霉素G的催化活性。 时加入5 L100mg／mL的IPTG诱导 目的蛋白青霉素扩环酶 的表达，25℃、220r／rain摇床培养3h。 1 材料与方法 1．2．3 蛋白的SDS—PAGE检测 取适量蛋白溶液加入相 1．1 材料菌株质粒 当于其体积 1／5的6×蛋白上样buffer，沸水煮5min，进行上 大肠杆菌BL21(DE3)(E．coli)，大肠杆菌ESS(E．coli)， 样。浓缩过程电压为8V／cm，当染料前沿进入分离胶后，将 棒状链霉菌P1(S clavuligerus)；pET—SC载体。PenicillinG 电压调至 15V／cm，电泳时间约为4h。用0．25％考马斯亮蓝 购 自Sigma—Aldrich，青霉素酶购 自Becton—Dickinson。 ． R一250冰醋酸甲醇溶液染色 1h，用7％冰醋酸甲醇溶液脱 1．2 试验 方法 色过夜 。 1．2．1 定点突变 以构建好的野生型ScDAOCS的表达载体 1．2．4 生物活性测定(抑菌圈方法) 取出 10 的各反应 pET—SC为模板，设计均含有突变位点的、部分互补的突变 液点在孔内并在37℃培养过夜(平板正放)。青霉素酶被加 引物进行PCR。在 PCR产物中加入 1 DpnI酶，37℃酶 在LB培养基中以消除没有转化的青霉素G底物 J。