实时定量PCR技术开发.pdf

定量PCR的应用和开发 陈云地 8008100192，8008203939-407 chenyd@ 1 提 要 应用开发指南 引物设计软件 实验设计思路 技术应用举例 2 应用开发指南 应用开发基本流程 使用Primer Express™软件设计引物和探针 Use 优化引物和探针的浓度 Primers: 900 nM each ；Probe: 250 nM each ( generally, Primers: 300 nM each; Probe: 200 nM) 证实系统只能检测cDNA 不能检测基因组DNA Assay Development Complete 注意避免單管及小體積操作 4 应用开发指南 • 探针设计指南 – 免费赠送Primer Express软件 – TaqMan探针Tm 68ºC - 70ºC – MGB探针Tm 65ºC - 67ºC • 引物设计指南 – 引物 Tm 58ºC - 60ºC – 短PCR产物 50-150 bp • PCR程序指南 – 通用的PCR条件 2步法：95ºC @ 15sec, 60ºC @ 1 min • 实验条件快速优化指南 – 所有实验在同样条件下完成 – 固定的PCR试剂浓度 2X TaqMan® Universal PCR Master Mix – 只需简单优化引物/探针浓度 5 引物设计指南 1. 先设计探针，再设计引物； 2. 引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针 重叠； 3. G-C含量保持在30-80%之间； 4. 避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续 4个或更多的G； 5. 用Primer Express® 软件计算出来的Tm值应 当在58-60 °C之间； 6. 在引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不 要超过2个。 6 为什么要避免3’端的G和C？ Design rule: 5 nucleotides at the 3 end have only 1-2 G+C’s 5 primer 3 polymerisation template Transient binding at 3 end of probe is quickly stabilised by the DNA polymerase 7 MGB探针设计指南 1. 探针的5 端第一个碱基不能是G； 2. 用Primer Express®软件计算出来的MGB探针Tm值在65 - 67°C 之间； 3. 探针要尽可能地短，但是不要短于13