新型氨基甲酸乙酯人工抗原的分析表征方法研究.pdfVIP

第4 1 卷 分析化学(FENXI HUAXUE )摇 研究报告 第2 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2013 年2 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 193 ~198 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.20600 新型氨基甲酸乙酯人工抗原的分析表征方法研究 * 郭 明 摇 周 伟摇 周 珊摇 敬 娇摇 杨 萍 (浙江农林大学化学系,临安311300 ) 摘摇 要摇 采用1鄄(3鄄二甲氨基丙基)鄄3鄄乙基碳二亚胺方法合成氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC )新型人工抗 原。 将衰减全反射红外光谱法(ATR鄄FTIR )应用于人工合成抗原的表征分析,并结合荧光光谱分析EC 人工 抗原的偶联效果以及载体蛋白质分子的二级结构变化;通过质谱结合紫外光谱、电泳方法进行人工抗原的系 统表征,计算新型人工抗原中半抗原分子与载体蛋白质分子的偶联比。 结果表明:合成路线合理,成功获得 了氨基甲酸乙酯新型人工抗原。 人工抗原分子的琢鄄螺旋、茁鄄折叠和茁鄄转角结构与载体蛋白质分子相比含量 发生变化,人工抗原的荧光相图满足线性型态变迁关系,符合“二态模型冶。 氨基甲酸乙酯人工抗原分析表征 的红外衰减全反射方法、基质辅助激光解析飞行时间质谱法获得的检测结果与其它光谱方法、电泳方法表征 结果一致,获得人工抗原的偶联比为15 颐1 ~19 颐1 ,EC 新型人工抗原免疫小鼠抗血清的效价为1 颐25600 。 关键词摇 氨基甲酸乙酯;人工抗原;红外光谱;二级结构 1摇 引摇 言 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate, EC )为食品中的多位点致癌物。 目前,EC 的检测主要依靠气相色 [1,2] 谱鄄质谱联用及其衍生方法,费用高、样品前处理繁琐 ,开展EC 分析检测新技术的研究受到关注。 酶联 免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay ,ELISA )在有害物的分析检测领域引起人们高度重 [3 ~5] 视 。 ELISA 方法的关键步骤是获得高效价抗原,而EC 为不具有免疫原性的半抗原分子,需合成EC 人 工抗原分子才能建立EC 检测的ELISA 方法。 由于EC 的分子结构特征性不明显,故缺乏高效的EC 人工 抗原检测手段,开展针对EC 的ELISA 检测体系研究并建立EC 人工抗原的分析检测技术具有重要意义。 2摇 实验部分 2.1摇 仪器、试剂及实验动物 基质辅助激光解析飞行时间质谱(Voyager鄄DE STR ,美国应用生物系统公司);IR Prestige鄄2 1 傅立 叶变换红外光谱仪、UV2550 紫外分光光度计、荧光分光光度计(F4500 ,日本岛津公司);垂直电泳装置 (美国Bio鄄Rad 公司);酶标仪(iMark 680 ,美国Bio鄄Rad 公司)。 牛血清白蛋白(BSA ,逸98% ,Sigma 公司);氨基甲酸乙酯(EC ,99% ,日本TCI 公司);1鄄(3鄄二甲氨 基丙基)鄄3鄄乙基碳二亚胺(EDC ,Sigma 公司)等试剂均为分析纯,实验用水为Milli鄄Q 级纯水。 BALB/c 小鼠(雄性,6 周龄,浙江省医学科学院实验动物中心)。 2.2摇 实验方法 2.2.1摇 氨基甲酸乙酯人工抗原的合成摇 5 mg EDC 和5 mg EC 分别溶于2 mL 0 .01 mol/L 、pH 7 .4 的磷 酸盐缓冲液(PBS, pH 7 .4 ) 中,分别制成A 、B 液;25 mg BSA 溶于1 mL 0 .01 mol/L, PBS 缓冲液(pH 7 . 4 )中,制成C 液。 将B 液逐滴加入C 液,室温下避