目基因制备.ppt

第四章 目的基因的制备 第一节 目的基因 1. 基因的组成 基因：染色体上具有遗传功能的DNA片段，它包括结构基因和相关的调控序列。 目的基因：决定生物的优良性状、具有应用价 值或应用前景，并被用于构建物种新特性的基因。 结构基因：包括从5’端mRNA转录位点开始到3’端mRNA转录终止信号结束的全部功能单位。这些功能单位包括：转录启动区、核糖体识别和结合区、编码区（起始密码，开读框、终止密码）、转录终止区。 1) 原核生物的基因组成 操纵子（Operon）：功能密切相关的基因聚 集在一起，处于同一个转录启动区的调控 之下，并具有相同的转录终止区. 启动区：RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。 SD序列：核糖体识别和结合的序列，通常位于起译密码子上游4-9bp处。序列特征为：AGGAGG, 它与核糖体核糖体16S rRNA的3‘序列3’ UCCUCC 5’互补配对，从而使核糖体与mRNA结合,启动翻译过程。 编码区： 翻译起始密码（ATG）：位于SD序列后4-9bp 多肽链编码区： 翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：某些基因后面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止密码. 转录终止区 终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供 转录终止信号的DNA序列（Terminator）. 特点：回文结构，转录后可形成发夹状的结 构，从而使聚合酶减慢或停止前进. a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子） 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b）依赖于终止因子（?）的终止子. 不含寡聚T序列，回文结构不含富GC的序列 终止因子：帮助RNA聚合酶识别终止信号的 辅助因子（Termination factor） 终止子发夹结构 2) 真核生物基因组成 真核生物基因组的一般特点 a）基因位于染色体上，基因之间存在较长 的非编码区 b）一个结构基因内有一个或多个非编码的 间隔序列 转录启动区：真核生物的三类RNA(rRNA, mRNA, tRNA)分别由RNA聚合酶I、II和III进行转录.它们启动子的结构也不相同.编码蛋白质的启动子由RNA聚合酶II识别. 基因区： 特点：a）无类似于原核基因中的核糖体识别区 b）含有不编码的间隔序列 3) 其它基因组的特点 病毒（噬菌体）基因组的特点 a）编码的基因位于DNA或RNA上 b）以多顺反子进行转录（SV40） c）部分基因重叠并含有内含子 线粒体基因组的特点 a）DNA编码的蛋白与能量代谢有关 b）以多顺反子进行转录 c）无S.D序列 d）动物线粒体基因无内含子，某些植物线粒 体基因有内含子 叶绿体基因组的特点 a）DNA编码与光合作用有关的蛋白或酶 b）以多顺反子进行转录 c）含有类似于原核基因组的启动子和S.D序列 2. 基因的特殊排列 对于大多数基因来说，基因组中的基因一个接一个排列在DNA分子上，在基因之间存在长度不等的间隔区，但某些生物基因组中的基因存在重叠，重复，加倍和重排等现象 1）基因重叠 一个基因内包含另一个基因的现象 a）部分重叠 ：两个基因的序列部分重叠 b）完全重叠：一个基因完全包含在另一个基因内 SV40基因组的结构 2）重复基因 在某些生物基因组中，某些基因存在多个拷贝的现象 * 真核生物基因组中组蛋白基因 3）加倍基因 同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因 * 高等生物含有两倍以上的染色体 * 细菌质粒DNA * 蓝藻染色体 4）基因重排 在生物的发育过程中，同一基因簇中的基因在不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与细胞功能的分化及表达有关. * 蓝藻细胞中的营养细胞和异形胞中的nif基因存在重排现象 第二节 目的基因的制备 1.目的基因的直接分离 1) 限制性核酸内切酶酶切分离：对于已知序列的DNA分子，根据DNA分子上的酶切位点进行切割，然后分离所需片断。 2) 物理化学分离法：根据不同DNA或RNA分子特性的差异，采用密度梯度离心、分子杂交等方法将目的基因分离出来。 3) 免疫法分离编码特异性蛋白基因：核糖体沿mRNA进行转译时产生多肽链，通过特异性抗体与核糖体－mRNA－多肽链复合体结合，然后分离纯化抗体－核糖体－mRNA－多肽链复合体，获得特定基因的mRNA。 4)酶促反转录分离特定基因：在反转录酶的作用下，合成双链DNA，获得一定大小的基